——以human IL-6 instant ELISA為例（cat#BMS213INST）

注意事項(xiàng)：

1. 試驗(yàn)中使用特定試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品和抗體，不建議不同試劑盒產(chǎn)品調(diào)換，因?yàn)榭赡苡绊懡Y(jié)果準(zhǔn)確性。

2. 稀釋用的緩沖液中不能含有疊氮化鈉，因?yàn)槠淇梢詼缁罾备^氧化物酶。

3. 儲存或孵育時(shí)避開強(qiáng)光。

4. 注意人員防護(hù)，避免試劑接觸皮膚。

5. 底物溶液避免接觸氧化劑和金屬。

6. 底物使用前請平衡至室溫。

7. 緩沖液稀釋后有效期為一個(gè)月。

儲存和穩(wěn)定性說明

1. 試劑盒提供凍結(jié)的標(biāo)準(zhǔn)品，對照干粉和平板，收到后請立即凍存于-20度冰箱，有效期見標(biāo)簽。

2. 重復(fù)使用試劑請避免污染。

樣品及收集注意事項(xiàng)

1. 本試劑盒適用血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清。

2. 取血清時(shí)注意凝結(jié)后立即取出血清凍存于-20攝氏度一下，避免IL-6活性降低。

3. 樣品出現(xiàn)沉淀請離心去除，避免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4. 嚴(yán)重溶血或高血脂樣品不能使用。

5. 避免樣品反復(fù)凍融，使用前平衡至室溫，小心混勻。

實(shí)驗(yàn)材料：

1) 預(yù)包被human IL-6抗體的微孔板+結(jié)合生物素的檢測抗體+抗生物素的辣根過氧化物酶。+Human IL-6標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2) 25ml 濃縮wash buffer 20×。

3) 12ml樣品稀釋液。

4) 15ml TMB底物(四甲基聯(lián)苯胺)。

5) 15ml 終止液：1M H3PO4 或者2N H2SO4

6) Control high 一瓶（凍干粉）。

7) Control low 一瓶（凍干粉）。

8) 封口膜。

儀器

吸管和單通或多通移液器

冰箱

排槍取液水槽

酶標(biāo)儀

洗板機(jī)

準(zhǔn)備試劑和樣品

1) 將濃縮洗液（20×）平衡至室溫，稀釋為1×。

2) Control 干粉處理：加300ul 雙蒸水小心重懸干粉10~30min，使其完全溶解，使用前請小心混勻。按照C of A 處理control 范圍，重懸后的液體儲存于-20攝氏度，避免反復(fù)凍融。

實(shí)驗(yàn)流程：

注意：

★ 從-20℃冰箱取出板子后立即使用，防止變質(zhì)。

★ 小心除去standard孔膜，是凍干粉沉在底部，避免膜帶走干粉。

★ 加入雙蒸水后無需等待其完全溶解即可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

★ 嚴(yán)禁用TIP頭混勻孔內(nèi)溶液，因?yàn)闀醋咴噭┯绊懡Y(jié)果。

★ 400ul洗液洗板，洗滌除去孔壁粘附的殘留物，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1 按照試驗(yàn)計(jì)劃準(zhǔn)備孔板A1/A2?~H1/H2（如表1）。

2 按照標(biāo)簽所示，向standard 和blank孔加入50ul（標(biāo)簽所示）雙蒸水(A1/A2?~H1/H2)。

3 向樣品孔中加入100ul 雙蒸水。

4 向樣品孔加入樣品25ul ，包括復(fù)孔，小心混勻。

5 封口膜封板，室溫（18—25攝氏度）孵育2小時(shí)，200rpm，震蕩（若不震蕩所得的OD值可能偏低，但是仍然可用）。

6 棄掉液體，加400ul洗液，15s左右，棄掉排干，重復(fù)3次（避免孔過于干燥）。

7 向各孔加TMB底物100ul，室溫避光孵育10min，觀察顯色最佳時(shí)間（標(biāo)準(zhǔn)品最高濃度變?yōu)樯钏{(lán)色或陽性對照不再有變化的時(shí)候）。

8 迅速加入100ul 終止液終止酶反應(yīng)，2~8度避光1h內(nèi)檢測讀板。

結(jié)果計(jì)算：（需要從標(biāo)準(zhǔn)品OD值擬合出來方程來推算樣品的細(xì)胞因子的含量）。

1. 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品，空白和樣品孔平均OD值。

2. 樣品OD值減去空白孔平均OD值。

3. 利用軟件擬合出4參數(shù)的對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以使用描點(diǎn)的方法在坐標(biāo)中描繪出X軸為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，Y軸為平均OD值的各個(gè)點(diǎn)，然后大致擬合出相應(yīng)的曲線。最佳的方法是使用回歸分析的方法擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4. 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的公式去計(jì)算樣品中細(xì)胞因子的濃度。

5. 如果在實(shí)驗(yàn)前樣品經(jīng)過稀釋，則結(jié)果需要乘于稀釋倍數(shù)。