注意：

1.試驗(yàn)中使用特定試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品和抗體，不建議不同試劑盒產(chǎn)品調(diào)換，因?yàn)榭赡苡绊懡Y(jié)果準(zhǔn)確性。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線孔建議做2-3個(gè)復(fù)孔。

3.稀釋用的緩沖液中不能含有疊氮化鈉，因?yàn)槠淇梢詼缁罾备^(guò)氧化物酶。

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋（如下圖）

1.按照C of A說(shuō)明使用檢測(cè)稀釋液配制濃度為500pg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.在高親和ELISA板子中從B1和B2開(kāi)始到H1和H2每孔分別加入100ul檢測(cè)稀釋液。

3.取200ul的濃度為500pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品加入到A1和A2兩個(gè)孔中。

4.用排槍從A1和A2兩個(gè)孔中吸取100ul加入到對(duì)應(yīng)的B1和B2中，吹吸混合均勻，那么 B1和B2標(biāo)準(zhǔn)品濃度為250pg/ml。

5.從B1和B2中吸取100ul加入到C1和C2孔中，混勻，那么C1和C2孔標(biāo)準(zhǔn)品濃度為125pg/ml。

6.按照步驟4和5的方法倍比稀釋到H1和H2兩孔。H1和H2孔中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是4pg/ml，體積為200ul，取100ul棄掉。屆時(shí)每個(gè)孔標(biāo)準(zhǔn)品的體積均為100ul。

注意：4到6步驟稀釋速度要快，避免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，建議使用多通道排槍進(jìn)行。

7.設(shè)置A3和A4為空白對(duì)照（只加100ul稀釋液），為了避免胡克效應(yīng)的影響，我們建議可以采用A1和A12作為空白對(duì)照孔，而不設(shè)置樣品或標(biāo)準(zhǔn)品。

結(jié)果計(jì)算：（需要從標(biāo)準(zhǔn)品OD值擬合出來(lái)方程來(lái)推算樣品的細(xì)胞因子的含量）。

1.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品，空白和樣品孔平均OD值。

2.樣品OD值減去空白孔平均OD值。

3.利用軟件擬合出4參數(shù)的對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以使用描點(diǎn)的方法在坐標(biāo)中描繪出X軸為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，Y軸為平均OD值的各個(gè)點(diǎn)，然后大致擬合出相應(yīng)的曲線。最佳的方法是使用回歸分析的方法擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.利用標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的公式去計(jì)算樣品中細(xì)胞因子的濃度。

5.如果在實(shí)驗(yàn)前樣品經(jīng)過(guò)稀釋，則結(jié)果需要乘于稀釋倍數(shù)。

儲(chǔ)存和穩(wěn)定性說(shuō)明

1.EB的ELISA試劑盒若按照說(shuō)明書(shū)儲(chǔ)存保質(zhì)期為6個(gè)月。

2.試劑盒提供凍結(jié)的標(biāo)準(zhǔn)品20ul/瓶，收到后請(qǐng)立即凍存與-80度冰箱，可保存6個(gè)月；使用時(shí)融化離心1分鐘，可避免標(biāo)準(zhǔn)品損失。請(qǐng)避免將標(biāo)準(zhǔn)品分裝和反復(fù)凍融。每瓶標(biāo)準(zhǔn)品只能用一次，剩余失效。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品步驟請(qǐng)參照說(shuō)明書(shū)第一部分。

3.ELISA板子請(qǐng)室溫儲(chǔ)存，其他試劑4度儲(chǔ)存即可。

實(shí)驗(yàn)材料：

功能純化級(jí)別的捕獲抗體。

結(jié)合生物素的檢測(cè)抗體。

標(biāo)準(zhǔn)品。

10×ELISA包被緩沖液。

5×檢測(cè)稀釋液。

抗生物素的辣根過(guò)氧化物酶。

TMB底物。

高親和力96孔板（NUNC Maxisorp flat-bottom or Corning Costar 9018）。

1×PBS+0.05%吐溫20（或者ELISA洗液 Cat.No. 00-0400）

終止液：1M H3PO4 或者2N H2SO4

儀器

吸管和單通或多通移液器

冰箱

排槍水槽

分光光度計(jì)

洗板機(jī)

實(shí)驗(yàn)流程：

1.使用無(wú)菌水將包被液稀釋為1×（注意：預(yù)先將包被液平衡至室溫）。

2.用1×包被液稀釋功能級(jí)別的包被抗體，包被ELISA板子，每孔100ul，蓋板，四度孵育過(guò)夜。

3.第二天稀釋檢測(cè)稀釋液（雙蒸水稀釋），吸出板子的捕獲抗體溶液，用300ul洗液洗板3-5次，每次浸泡時(shí)間不小于1min,吸水紙上排干。

4.200ul檢測(cè)稀釋液封閉板子，蓋板，室溫孵育1小時(shí)。

5.吸去檢測(cè)稀釋液，用300ul洗液洗板3-4次，每次浸泡時(shí)間不小于1min,吸水紙上排干。

6.按照上述說(shuō)明使用1×檢測(cè)稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）。

7.加100ul樣品和標(biāo)準(zhǔn)品到對(duì)應(yīng)的孔中，封板，室溫孵育2個(gè)小時(shí)或4度過(guò)夜（高靈敏度）。

8.孵育期間，按照說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備檢測(cè)抗體。

9.吸去樣品，用300ul洗液洗板5次，每次浸泡時(shí)間不小于1min,吸水紙上排干。

10.每孔加100ul檢測(cè)抗體，封板，室溫孵育1個(gè)小時(shí)。

11.孵育期間，按照說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備抗生物素的HRP溶液。

12.每孔加100ul抗生物素的HRP溶液，封板，室溫孵育0.5個(gè)小時(shí)（避免溶液中有疊氮鈉，因?yàn)闀?huì)影響HRP活性）。

13.吸去溶液，用300ul洗液洗板3-4次，每次浸泡時(shí)間不小于1min,吸水紙上排干。

14.每孔加100ulTMB溶液，封板，室溫孵育15min（注意：TMB要預(yù)先平衡至室溫）。

15.加50ul終止液終止。

16.加終止液后30min內(nèi)檢測(cè)，450nm讀板。

附錄：緩沖液配制方法

1X PBS: 

　80.0 g NaCl

　11.6 g Na2HPO3

　2.0 g KH2PO4

　2.0 g KCl

　以 1 L DI H2O定容 并調(diào)節(jié) pH 值為 7.0

ELISA Wash Buffer:

　1 L 的1X PBS

　0.5 mL Tween-20

　此外, 也可以購(gòu)買(mǎi)ELISA洗液干粉 (eBio cat. # 00-0400) ，用1 L DI H2O重懸。