注意：試劑盒組成和緩沖液制備、稀釋及儲(chǔ)存條件請(qǐng)參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，本方案不在贅述。

實(shí)驗(yàn)方案一

A． 樣品制備

貼壁細(xì)胞

1. 小心除去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞一次，若細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板，加入100ul新鮮配制的1x Cell Lysis Mix 裂解細(xì)胞，300轉(zhuǎn)/min 室溫震蕩裂解10min。

注意：裂解液體積需要依據(jù)裂解物濃度調(diào)整。一般裂解物中蛋白含量在0.1—0.5mg/ml就足夠?qū)嶒?yàn)檢測(cè)。但是制備高濃度的裂解物有利于檢測(cè)出低豐度的靶蛋白。

非貼壁細(xì)胞

1. 300g 5min離心出去培養(yǎng)基，用PBS洗滌一次，然后使用含有5%的HBSS或PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度（10000-25000 cells/well）確保能裂解后蛋白濃度在0.1—0.5mg/ml。

注意：檢測(cè)時(shí)避免用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中一些成分可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。例如RPMI1640中含有生物素會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。

2. 【可選】將細(xì)胞置于37度培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-2小時(shí)。（一些信號(hào)通路需要激活細(xì)胞才能檢測(cè)到）

3. 向細(xì)胞懸液中加入終體積20%的5X Cell Lysis Mix, 300轉(zhuǎn)/min 室溫震蕩裂解10min?；蛘唠x心棄上清用1x Cell Lysis Mix重懸裂解細(xì)胞。

B． 檢測(cè)方案 

1. 向檢測(cè)孔中加入50ul陽(yáng)性對(duì)照、50ul的1x Cell Lysis Mix作為陰性對(duì)照和50ul樣品裂解物。

2. 向檢測(cè)孔加入50ul/well 預(yù)先配置的antibody cocktail ,小心封板，室溫震蕩孵育1h。

注意：檢測(cè)試劑使用前要平衡至室溫。

3. 200ul/well 洗液洗滌3次，最后一次吸水紙上排干。

4. 向每孔加入100ul Detection Reagent 室溫孵育10-30min。根據(jù)顯色來(lái)調(diào)整時(shí)間，高豐度顯色快，低豐度顯色慢。

5. 每孔加100ul終止液終止。

6. 終止后一小時(shí)內(nèi)450nm酶標(biāo)儀讀板。

實(shí)驗(yàn)方案二

本方案適用于在InstantOne 裂解細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，也就是ALL-In-One-Well。

A. 樣品制備

1. 離心收獲細(xì)胞用1XPBS+5%BSA調(diào)整細(xì)胞濃度使10000-25000cells in 20ul（足夠許多細(xì)胞系使用）。注意：檢測(cè)時(shí)避免用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中一些成分可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。例如RPMI1640中含有生物素會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。

2. 計(jì)算使用InstantOne板條數(shù)目，安排實(shí)驗(yàn)孔布局。

3. 使用200ul/well無(wú)菌蒸餾水洗滌板孔兩次，出去空內(nèi)防腐劑。

4. 向孔中加入20ul細(xì)胞懸液?！究蛇x】將細(xì)胞置于37度培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-2小時(shí)。（一些信號(hào)通路需要激活細(xì)胞才能檢測(cè)到）

5. 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同時(shí)間點(diǎn)，每孔加入20ul 處理劑（例如2X激動(dòng)劑或拮抗劑）。此外，避免使用培養(yǎng)基。

6. 直接加10ul 5x Cell Lysis Mix 300轉(zhuǎn)/min 室溫震蕩裂解10min。

B. 檢測(cè)方案

1. 向檢測(cè)孔中加入50ul陽(yáng)性對(duì)照、50ul的1x Cell Lysis Mix作為陰性對(duì)照。

2. 向檢測(cè)孔加入50ul/well 預(yù)先配置的antibody cocktail ,小心封板，室溫震蕩孵育1h。a) 注意：檢測(cè)試劑使用前要平衡至室溫。

3. 200ul/well 洗液洗滌3次，最后一次吸水紙上排干。

4. 向每孔加入100ul Detection Reagent 室溫孵育10-30min。根據(jù)顯色來(lái)調(diào)整時(shí)間，高豐度顯色快，低豐度顯色慢。

5. 每孔加100ul終止液終止。

6. 終止后一小時(shí)內(nèi)450nm酶標(biāo)儀讀板。