（以BMS606 mouse IFN-gamma ELISA為例）

注意事項：

1. 試驗中使用特定試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品和抗體，不建議不同試劑盒產(chǎn)品調(diào)換，因為可能影響結(jié)果準(zhǔn)確性。

2. 稀釋用的緩沖液中不能含有疊氮化鈉，因為其可以滅活辣根過氧化物酶。

3. 儲存或孵育時避開強(qiáng)光。

4. 注意人員防護(hù)，避免試劑接觸皮膚。

5. 底物溶液避免接觸氧化劑和金屬。

6. 底物使用前請平衡至室溫。

7. 緩沖液稀釋后有效期為一個月，放大液現(xiàn)用現(xiàn)配（配好立即加到板子中）。

儲存和穩(wěn)定性說明

1. 試劑盒提供凍結(jié)的標(biāo)準(zhǔn)品，對照干粉和平板，收到后請存于4~8度冰箱，有效期見標(biāo)簽。

2. 重復(fù)使用試劑請避免污染。

1. 本試劑盒適用血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清。

2. 取血清時注意凝結(jié)后立即取出血清凍存于-20攝氏度一下，避免IFN-gamma活性降低。

3. 樣品出現(xiàn)沉淀請離心去除，避免影響實驗結(jié)果。

4. 嚴(yán)重溶血或高血脂樣品不能使用。

5. 避免樣品反復(fù)凍融，使用前平衡至室溫，小心混勻。

試劑準(zhǔn)備：

1. 1×Washing buffer：50ml 20×washing buffer concentrate+950ml ddH2O 混合均勻，4~25攝氏度保存一個月。

2. Assay buffer 用水稀釋為1×。

3. 用1×assay buffer 稀釋biotin-檢測抗體100：1.

4. 用1×assay buffer 稀釋streptavidin-HRP 100:1

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋（如下圖）

1. 按照C of A說明使用無菌雙蒸水配制濃度為2ng/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，四度平衡混勻10—30min。

2. 使用1xAssay Buffer按如下方案稀釋（1：2）

小心混勻，終濃度為1000pg/ml.

3. 在ELISA板子中從A1和A2開始到H1和H2每孔分別加入100ul檢測稀釋液。

4. 取100ul的濃度為2000pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品加入到A1和A2兩個孔中。

5. 用排槍從A1和A2兩個孔中吸取100ul加入到對應(yīng)的B1和B2中，吹吸混合均勻，那么 B1和B2標(biāo)準(zhǔn)品濃度為500pg/ml。

6. 從B1和B2中吸取100ul加入到C1和C2孔中，混勻，那么C1和C2孔標(biāo)準(zhǔn)品濃度為250pg/ml。

7. 按照步驟4和5的方法倍比稀釋到G1和G2兩孔。G1和G2孔中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是15.6pg/ml，體積為225ul。

注意：4到6步驟稀釋速度要快，避免時間過長，建議使用多通道排槍進(jìn)行。

8. 設(shè)置H1和H2為空白對照（只加100ul稀釋液），為了避免胡克效應(yīng)的影響，我們建議可以采用A1和A12作為空白對照孔，而不設(shè)置樣品或標(biāo)準(zhǔn)品。

實驗材料：

1. 鋁鉑包預(yù)包被mouse IFN-??抗體的ELISA板。

2. 100ul結(jié)合生物素的anti-mouse IFN-?檢測抗體。

3. 2瓶mouse IFN-?標(biāo)準(zhǔn)品干粉，2ng/ml以上濃度重懸。

4. 10×ELISA包被緩沖液。

5. 1瓶12ml樣品稀釋液。

6. 1瓶檢測濃縮液（20X）5ml（1XPBS+1%Tween20+10%BSA）。

7. 1瓶濃縮洗液（50ml,20X,1XPBS+1%Tween20）

8. 1瓶底物（15ml）

9. 1瓶終止液（15ml,1M 磷酸）

10. 封板膜

11. 藍(lán)色、綠色和紅色三瓶染料（各0.4ml）

儀器

1. 吸管和單通或多通移液器

2. 冰箱

3. 排槍水槽

4. 分光光度計

5. 洗板機(jī)

實驗流程：

注意：孵育時間和洗滌次數(shù)請嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行，不得隨意更改。

放大液要使用之前現(xiàn)配先用，不得預(yù)先配置，洗滌效果對結(jié)果至關(guān)重要。

1. 取出板子，安排樣品，標(biāo)準(zhǔn)品排布順序。

2. 用400ul1×洗液洗滌ELISA板子兩次，每次10—15s(小心不得抓板孔表面，洗滌間歇不得過大，不能使板孔晾干)。

3. 按下圖稀釋標(biāo)準(zhǔn)品(在培養(yǎng)板中稀釋)。

4. 加100ul樣品稀釋液至H1，H2孔中。

5. 加50ul 樣品稀釋液到樣品孔中，加50ul樣品到樣品孔中。

6. 準(zhǔn)備生物化抗體（檢測抗體），所有孔中各加50ul，封板室溫（18-25攝氏度）震蕩(100rpm/min)孵育2h。

7. 準(zhǔn)備抗生物素的HRP，棄掉板子中液體，并用洗液洗滌3次。

8. 向所有孔中個加100ul稀釋好的HRP，封板室溫（18-25攝氏度）震蕩(100rpm/min)孵育1h。

9. 棄掉板子中液體，并用洗液洗滌3次，向所有孔中個加100ulTMB底物。封板室溫（18-25攝氏度）孵育10-20min，每孔加100ul終止液。

10. 450nm讀板。

結(jié)果計算：（需要從標(biāo)準(zhǔn)品OD值擬合出來方程來推算樣品的細(xì)胞因子的含量）。

1. 計算標(biāo)準(zhǔn)品，空白和樣品孔平均OD值。

2. 樣品OD值減去空白孔平均OD值。

3. 利用軟件擬合出4參數(shù)的對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以使用描點的方法在坐標(biāo)中描繪出X軸為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，Y軸為平均OD值的各個點，然后大致擬合出相應(yīng)的曲線。最佳的方法是使用回歸分析的方法擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4. 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的公式去計算樣品中細(xì)胞因子的濃度。

5. 如果在實驗前樣品經(jīng)過稀釋，則結(jié)果需要乘于稀釋倍數(shù)。