ELISPot操作流程：

1. ELISPOT包被

2. 每孔加 入20μl的70％乙醇預濕PVDF膜、甩干。用無菌PBS洗滌，每孔加入100μl， 洗滌2次去除乙醇。用滅菌PBS稀釋包被抗體，每孔加 入100μl已稀釋好的包被抗體(終濃度10μg/ml)到各實驗孔。4°C包被過夜或室溫包被2小時。

2. 封閉

傾倒包被液，用無 菌PBS洗滌3次。最后一次，在滅菌的吸水紙上扣干。每孔加入200μl細胞培養(yǎng)液封閉，室溫孵育1小時。

3. 細胞培養(yǎng)

傾倒封閉液，須洗滌，直接加入準備好的細胞。（初次進行試驗，應作刺激物濃度梯度、和∕或細胞計數(shù)梯度預實驗）實驗組孔加入細胞和刺激物，陽性對照組每孔 加入10μl PHA（PHA終濃度1-4ug/mL），陰性對照組每孔只加細胞。37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24h。

4. 檢測

用PBS/0.05%Tween-20 洗板3次。 甩干, 用抗體稀釋液（PBS＋1％BSA）稀釋檢測抗體。每孔加入1：1000稀釋好的生物素記檢測抗體100μl，室溫孵育2h。用 PBS/0.05%Tween-20 洗板3次。 甩干, 用抗體稀釋液（PBS＋1％BSA）稀釋酶親和素 ，每孔加入1：1000稀釋好的酶親和素 ，室溫孵育1h。

5. 顯色

用PBS/0.05%Tween-20 洗板3次，PBS洗板1次。拍干。加 入50μl BCIP·NBT顯色液。室溫靜置15-45min，注意避光。

6. 終止顯色自來水沖洗板子，室溫干燥后在倒置顯微鏡下觀察結果或使用自動酶聯(lián)斑點圖像分析儀進行分析。