Foxp3 染色過(guò)程　　

下面是人的Foxp3用結(jié)合Foxp3抗體（例如 PCH或者236A/E7克隆）的熒光染料進(jìn)行胞內(nèi)染色的過(guò)程。請(qǐng)參照相應(yīng)的特異性克隆過(guò)程。小鼠或者大鼠組織的染色在用固定/透化液孵育過(guò)程時(shí)可能會(huì)稍 微改動(dòng)一下。Foxp3染色緩沖液的使用是很關(guān)鍵的?！　≡谌旧埃瑧?yīng)該把固定/透化濃縮液按1:3的比例稀釋?zhuān)司彌_液的儲(chǔ)存時(shí)間不能超過(guò)一天。例 如，12 份樣品，用3 ml固定/透化濃縮液和9 ml固定/透化稀釋液。在使用之前，10×透化濃縮液應(yīng)該稀釋為1×溶液

1． 加100 ?l 準(zhǔn)備好的細(xì)胞（1×106個(gè)/?l）加入到各個(gè)試管中；

2． 染色表面分子如CD4、CD8、CD25等，這個(gè)網(wǎng)站是表面染色過(guò)程（http://www.ebioscience.com/ebioscience/appls/FCS.htm）.

3． 用冷的流式液或冷的PBS洗滌；

4． 斡旋重懸細(xì)胞并且在每一個(gè)樣品中加入1 ml 新鮮的固定、透化液。再次渦旋。

5． 4 ℃避光孵育30-60 min；

6． 加入2 ml 1×透化液洗滌一次，然后離心沉淀并倒掉上清液；

7． 用100?l 2% 正常鼠的血清4 ℃封閉15分鐘；

8． 封閉后不用洗，加入20 ?l 結(jié)合Foxp3抗體的熒光染料或者同種對(duì)照，4 ℃避光孵育至少30min；

9． 加入2 ml 1×透化液洗滌，離心沉淀?xiàng)壍羯锨澹?/p>

10． 重復(fù)步驟9；

11． 用適當(dāng)?shù)牧魇饺玖暇彌_液重懸細(xì)胞，然后再流式細(xì)胞儀上分析。請(qǐng)注意由于固定和透化過(guò)程，細(xì)胞數(shù)量的FSC/SSC分布將和活細(xì)胞不同。因此門(mén)和電位差將會(huì)被修改。