流式胞內(nèi)染色實驗方法
流式胞內(nèi)蛋白染色，很關(guān)鍵的一點(diǎn)是需要知道要染的蛋白在哪個位置，這樣才能選對操作流程和buffer體系。例如，核內(nèi)蛋白和大部分分泌蛋白要用eBioscience 的Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience Cat. No. 00-5523)，而像細(xì)胞因子和趨化因子這類分泌蛋白要用Intracellular Fixation and Permeabilization Buffer Set (eBioscience Cat. No. 88-8824)。對于磷酸化信號通路蛋白，不能用以上兩種buffer體系，而要用Fixation/Methanol Protocol。
eBioscience針對流式胞內(nèi)染色推出了三種解決方案：
方案A：兩步法胞內(nèi)蛋白染色（細(xì)胞質(zhì)），用于檢測可以通過體內(nèi)或體外激活的單個細(xì)胞的胞漿蛋白、細(xì)胞因子或其他的分泌蛋白。
方案B：一步法胞內(nèi)蛋白染色（細(xì)胞核），用于檢測核內(nèi)蛋白，如轉(zhuǎn)錄因子。
方案C：兩步法Fixation/Methanol，用于檢測磷酸信號分子，如MAPK和STAT蛋白等。
注意：
1、 流式抗體要避光儲存于2-8°C，嚴(yán)格避免反復(fù)凍融。
2、 使用抗體前，快速旋轉(zhuǎn)使抗體恢復(fù)到最大體積，不建議斡旋混勻抗體。
3、 除操作說明外，所有的染色步驟一律在冰上或4℃避光操作。
4、 緩沖液中加BSA或FBS可以減少固定破膜后的非特異性背景。
5、 固定和透化作用將影響eFluor納米晶體的亮度，建議使用最短的固定和透化作用時間，染色后立即上機(jī)檢測分析。
方案A: 兩步法胞內(nèi)蛋白染色（細(xì)胞質(zhì)）
實驗材料：
12×75mm圓底檢測流式管。
[可選]可固定的活度染料eFluor?450,506,660, or 780 (eBioscience Cat. No. 65-
0863,65-0866,65-0864,65-0865)
胞內(nèi)抗原的直標(biāo)抗體。
胞內(nèi)Fixationand Permeabilization Buffer Set(eBioscienceCat. No. 88-8824)，稀釋到1x使用
Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)
刺激劑：CellStimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors)(500X)(eBioscience Cat.No. 00-4975) or ProteinTransport Inhibitor Cocktail(500X) (eBioscience Cat. No.00-4980) or Brefeldin ASolution (eBioscience Cat.No. 00-4506) or MonensinSolution (eBioscience Cat. No. 00-4505)
實驗流程：
1、按照流式樣品要求制備單細(xì)胞懸液。
2、按照流式表面染色方法標(biāo)記細(xì)胞表面抗原，緩沖液洗滌一次，離心完全棄上清。斡旋分散細(xì)胞。
3、加100ul ICFixationbuffer ，斡旋固定細(xì)胞，室溫避光孵育20-60min。
4、每管加2ml1×permeabilization buffer，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
5、每管加2ml1×permeabilization buffer重懸細(xì)胞，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
6、每管加100ul1×permeabilization buffer 重懸細(xì)胞后，加入檢測胞內(nèi)抗原的抗體，室溫避光孵育20-60min。
7、每管加2ml1×permeabilizationbuffer洗一次，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
8、每管加2ml FlowCytometry Staining Buffer，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
9、每管適量流式染色液重懸即可上機(jī)檢測，同行對照依照上述步驟進(jìn)行。
方案B：一步法胞內(nèi)蛋白染色（細(xì)胞核）
實驗材料：
12×75mm圓底檢測流式管或96孔尖底或圓底微孔板。
[可選]FixableViability Dyes eFluor 450, 506,660 and 780(eBioscience Cat. No. 65-
0863,65-0866,65-0864,65-0865)
胞內(nèi)抗原的直標(biāo)抗體。
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience Cat. No. 00-5523)
Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)
實驗流程一（試管）
1、按照流式樣品要求制備單細(xì)胞懸液。
2、按照流式表面染色方法標(biāo)記細(xì)胞表面抗原。緩沖液洗滌一次，離心完全棄上清。斡旋分散細(xì)胞。
3、每管加1mlFoxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定細(xì)胞。室溫或四度避光孵育30-60min（小鼠樣品最長可以四度固定18小時）。
4、每管加2ml1×permeabilizationbuffer，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
5、每管加2ml1×permeabilizationbuffer重懸細(xì)胞，300-400xg 室溫離心5min,棄上清。
6、每管加100ul1×permeabilizationbuffer重懸細(xì)胞。
7、可選：每管加入2ul 2%normal mouse/rat serum 封閉，室溫孵育15分鐘。
8、每管加入熒光標(biāo)記抗體，室溫避光孵育30min。
9、每管加2ml1×permeabilizationbuffer洗一次，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
10、每管加2ml1×permeabilizationbuffer或FlowCytometry Staining Buffer，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
11、每管加適量FlowCytometry Staining Buffer重懸細(xì)胞，即可上機(jī)檢測。同行對照依照上述步驟進(jìn)行。
實驗流程二（96孔微孔板）
1、按照流式樣品要求制備單細(xì)胞懸液。
2、按照流式表面染色方法標(biāo)記細(xì)胞表面抗原。緩沖液洗滌一次，離心完全棄上清。斡旋分散細(xì)胞。
3、每孔加200 μLFoxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定細(xì)胞。室溫或四度避光孵育30-60min（小鼠樣品最長可以四度固定18小時）。300-400xg室溫離心5min，棄上清。，
4、每孔加200 μL1×permeabilizationbuffer，300-400xg 室溫離心5min,棄上清。
5、重復(fù)步驟4。
6、每孔加100ul1×permeabilizationbuffer重懸細(xì)胞
7、可選：每孔加入2ul 2%normal mouse/rat serum 封閉，室溫孵育15分鐘。
8、每孔加入熒光標(biāo)記抗體，室溫避光孵育30min。
9、每孔加200 μL1×permeabilizationbuffer洗一次，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
10、每孔加200 μL1×permeabilizationbuffer或FlowCytometry Staining Buffer，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
11、每孔加適量Flow CytometryStaining Buffer重懸細(xì)胞，即可上機(jī)檢測。同行對照依照上述步驟進(jìn)行。
方案C：兩步法Fixation/Methanol
實驗材料：
12×75mm 圓底檢測流式管或96孔尖底或圓底微孔板。
胞內(nèi)抗原的直標(biāo)抗體
eBioscienceFlowCytometry Staining Buffer (Cat. No. 00-4222)
eBioscienceICFixation Buffer (cat. 00-8222)
90-100% 甲醇(HPLC 級)
可選Fc Block：Anti-Mouse CD16/CD32 Purified(eBioscienceCat. No. 14-0161) or Human Fc ReceptorBinding Inhibitor Purified(eBioscienceCat. No. 14-916 ）
實驗流程
1、準(zhǔn)備刺激細(xì)胞的刺激劑，用刺激劑重懸細(xì)胞使細(xì)胞濃度達(dá)1-5x106cells/mL，37℃培養(yǎng)一段時間（刺激時間依樣品而定）。取未刺激的細(xì)胞同樣處理作為陰性對照。
2、固定細(xì)胞：ICFixationBuffer按1:1直接加到細(xì)胞里，斡旋混勻，室溫，避光孵育10-60min。
3、室溫600xg離心4-5min，棄上清。
4、重懸細(xì)胞，加1mL冰冷的90-100%甲醇，渦旋混勻，4℃或冰上孵育至少30min。
注意：細(xì)胞加了甲醇，可以在<-20℃條件下保存超過4周。
5、用FlowCytometryStaining Buffer洗滌細(xì)胞，室溫600xg離心4-5min，棄上清。
6、用 FlowCytometryStaining Buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)至1x107cells/mL 。
7、取100 μL(1x106cells)細(xì)胞到流式管。
8、可選：染色前可以使用MouseCD16/ CD32抗體或人類Fc受體抑制非特異性結(jié)合。
9、加熒光標(biāo)記抗體，室溫避光孵育30-60min。
注意：如果需要，表面染色和胞內(nèi)磷酸染色可以同時進(jìn)行，因為不是所有的抗體克隆號都結(jié)合到一個固定位點(diǎn)，請查閱固定和甲醇處理后細(xì)胞染色的抗體克隆號表。
10、用2mL FlowCytometryStaining Buffer洗滌細(xì)胞，室溫600xg離心4-5min，棄上清。重復(fù)一次。
11、用適量的FlowCytometryStaining Buffer 重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測。同行對照依照上述步驟進(jìn)行。
實驗流程（96孔微孔板）
1、準(zhǔn)備刺激細(xì)胞的刺激劑，用刺激劑重懸細(xì)胞使細(xì)胞濃度達(dá)1-5x106cells/mL，
2、取96孔微孔板，每孔加100μL刺激劑，再加100 μL細(xì)胞，37℃培養(yǎng)一段時間（刺激時間依樣品而定）。取未刺激的細(xì)胞同樣處理作為陰性對照。
3、固定細(xì)胞：ICFixationBuffer按1:1直接加到細(xì)胞里，斡旋混勻，室溫，避光孵育10-60min。
4、室溫600xg離心4-5min，棄上清。
5、重懸細(xì)胞，加1mL冰冷的90-100%甲醇，渦旋混勻，4℃或冰上孵育至少30min
注意：細(xì)胞加了甲醇，可以在<C的條件下保存超過4周?！?20
6、用200 μLFlowCytometry Staining Buffer 洗滌細(xì)胞，室溫600xg離心4-5min，棄上清。重復(fù)一次。
7、可選：染色前可以使用Mouse 的CD16/CD32純化抗體或人類Fc受體抑制分特異性結(jié)合。
8、加熒光標(biāo)記抗體，室溫避光孵育30-60min。
注意：如果需要，表面染色和胞內(nèi)磷酸染色可以同時進(jìn)行，因為不是所有的抗體克隆號都結(jié)合到一個固定位點(diǎn)，請查閱固定和甲醇處理后細(xì)胞染色的抗體克隆號表。
9、用2mL FlowCytometryStaining Buffer洗滌細(xì)胞，室溫600xg離心4-5min，棄上清。重復(fù)一次。
10、用適量的FlowCytometryStaining Buffer 重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測。同行對照依照上述步驟進(jìn)行。
