方案A：細(xì)胞懸液的表面抗原染色。

方案B：一步法胞內(nèi)蛋白染色（細(xì)胞核）。

小貼士：

1、流式抗體要儲(chǔ)存于避光4度，嚴(yán)格避免凍融。

2、流式抗體使用前要離心3min，避免貼壁蓋的損失，請(qǐng)勿斡旋混勻。

3、避免細(xì)胞成團(tuán)，以免堵塞流式細(xì)胞儀。

4、eFluor納米晶體抗體參照該品說明進(jìn)行改善。

方案A: 細(xì)胞懸液的表面抗原染色

實(shí)驗(yàn)材料：

15×75mm圓底流式管或96孔板

直標(biāo)一抗或純化抗體

二抗（可選）

抗小鼠CD32/16抗體（eBioscience Cat. No. 14-0161）

人FC?R結(jié)合抑制劑（eBioscience Cat. No. 14-9161）

流式染色液（eBioscience Cat. No. 00-4222）可自行配制

eFluor納米晶體抗體染色液（eBioscience Cat. No. 00-3222；可選）

7-AAD活度染色液（eBioscience Cat. No. 00-6993）或PI染色液（eBioscience Cat. No. 00-6990）

實(shí)驗(yàn)流程： 

1、按照樣品細(xì)胞制備方案制備懸浮細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×107/ml。

2、（可選）封閉FCR介導(dǎo)的非特異性反應(yīng)：

小鼠：染色之前加0.5ug-1ug/100ul CD16/32抗體，孵育20min。

人類：染色之前加20ul 人FCR結(jié)合抑制劑孵育20min。

3、等分細(xì)胞懸液，每管50ul，再補(bǔ)加50ul染色液。

4、按照抗體說明書加入適量抗體，輕彈混勻。

5、直標(biāo)抗體。

方案B：淋巴組織細(xì)胞制備

實(shí)驗(yàn)材料：

60×15mm 的組織培養(yǎng)皿

[5ml 注射器

細(xì)胞過濾器（尼龍網(wǎng)過濾）

eBioscience? 流式染色緩沖液 (eBioscience Cat. No. 00-4222)

15ml或50ml的離心管。

注意：

Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate 1份加3份 Diluent 稀釋為工作液（1:4稀釋）。

實(shí)驗(yàn)方案： 

1、按照流式樣品要求制備單細(xì)胞懸液。

2、按照流式表面染色方法標(biāo)記CD3和CD4。緩沖液洗滌一次，離心完全棄上清。斡旋分散細(xì)胞。

3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定細(xì)胞。室溫或四度避光孵育30-60min（小鼠樣品最長可以四度固定18小時(shí)）。

4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。

5、300g 室溫離心5min,棄上清。

6、2ml 1×permeabilization buffer重懸細(xì)胞。

7、300g 室溫離心5min,棄上清。

8、加100ul 1×permeabilization buffer 重懸細(xì)胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞內(nèi)抗原抗體），室溫避光孵育20min。

9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室溫離心5min,棄上清。

10、加2ml 流式染色液，300g 室溫離心5min,棄上清。

11、適量流式染色液重懸，即可上機(jī)檢測。同行對(duì)照依照上述步驟進(jìn)行。軟件分析結(jié)果。