實驗材料：

　　Mouse, Rabbit 或Goat IgG TrueBlot?

　　TrueBlot? Ig IP 微球 or Protein A 或 G 微球

實驗設備：

　　SDS-PAGE電泳及轉膜相關設備和緩沖液；

　　微量移液器；

　　搖床；

　　PVDF或nitrocellulose膜；

　　WB結果檢測設備及底物

實驗步驟

　　1）. 免疫共沉淀（IP）和SDS-PAGE電泳

　　(1) 細胞裂解：往107/ml細胞中加入適量預冷的細胞裂解液和蛋白酶抑制劑，混勻4度孵育30-60分鐘后10000g離心15min，保留上清液。布氏法檢測蛋白濃度后，將樣品稀釋為1μg/μl左右。可-80度凍存或繼續(xù)下一步。

　　(2) 細胞裂解物的預清洗：加50ul之前用裂解液稀釋的相應種屬Ig IP Beads（or Protein A/G beads）到裝有500ul細胞裂解物的離心管中，冰上孵育30-60分鐘；2500×g離心2-3分鐘后把上清液（不能帶沉淀微球）轉移到新的離心管中。

　　(3) 免疫共沉淀：在裝有預清洗后的細胞裂解物的離心管中加入1-10ug的一抗，4°C孵育 1-2小時或者搖晃過夜。再加入50ul用裂解液預處理過的Ig IP Beads（or Protein A/G beads），4°C混勻孵育1-2小時或搖床過夜后2500×g離心0.5分鐘（可以和一抗一起孵育）。盡量完全地移去上清液并用500ul預冷的裂解液洗滌3次（每次都要離心棄完上清，有利于降低背景）。

　　(4) 最后一次洗滌并小心的吸掉上清液后，加入50ul 1X Laemmli sample buffer（或含50mM DTT的SDS Sample Loading Buffer）（注意Sample Loading Buffer成分必須含有還原劑）。Vortex混勻后加熱至90-100℃，10分鐘。10000×g離心5分鐘，小心收集上清。10-30ul上樣電泳，避免上樣Beads。

　　注：收集的上清液可以置于-20°C保存。用時解凍后，加入新鮮的DTT并加熱至90-100℃十分鐘。10000×g離心5分鐘，收集上清進行上樣電泳。

　　2）. 免疫印跡（Western Blotting）

　　(1) 如前所述SDS-PAGE電泳結束。

　　(2) 把蛋白質從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉移至NC膜上。麗春紅-S染色鑒定是否轉膜成功，考馬斯亮藍對SDS-PAGE進行染色分析轉膜效率，蒸餾水或TBST清洗麗春紅。

　　(3) 在通風柜里，將NC膜在True Blot enhancer buffer 浸泡2min，TBST清洗一次。

　　(4) 將NC膜浸入5%的脫脂奶粉的封閉液中，置于搖床上室溫封閉2小時。

　　(5) 棄去封閉液后，加入靶蛋白一抗（用5%脫脂奶粉封閉液稀釋，終濃度需要預實驗摸索，建議1-2ug/ml）。置于搖床上室溫孵育2小時或者4℃孵育過夜。

　　(6) 用TBST洗滌膜4-5次，每次5-10分鐘。

　　(7) 棄去洗液后加入適量的用5%脫脂奶粉封閉液稀釋好的TrueBlot?（稀釋比為1：1000），室溫孵育1小時。

　　(8) 用PBST或TBST洗滌膜4-5次，每次5-10分鐘。

　　(9) 用合適的過氧化物酶HRP化學發(fā)光底物并按照說明（等量的底物A+底物B）進行顯色反應。

　　(10) 在暗室中用X光片曝光，根據(jù)結果調整曝光時間（10sec、1min、5min和20min）和曝光區(qū)域,以得到最佳效果。

　　3）. 注意事項

　　(1) 免疫共沉淀抗體的稀釋：用于免疫共沉淀的抗體在使用之前需要進行稀釋，例如使用濃度為1-5ug/107細胞/ml。一般對于從107細胞裂解出的大部分蛋白抗原來說，加入2ug抗體就足夠了。因為盡量減少抗體用量可以降低還原性沉淀抗體對SDS-PAGE電泳樣品檢測的干擾。（TrueBlot?并不能增強免疫印跡中抗體和抗原之間的特異性結合，所以如果用于WB的抗體能與非目的蛋白產(chǎn)生交叉反應，結果也會被TrueBlot?檢測出來）

　　(2) WB的封閉：Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot?檢測過程中的膜封閉，一抗稀釋孵育和TrueBlot?稀釋孵育過程都建議使用5%（w/v）的脫脂奶粉液。BSA不建議使用于此過程。

　　(3) 陽性對照：Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot?檢測SDS-denatured, non-reduced mouse IgG，所以可用20ng non-reduced沉淀抗體直接上樣電泳，然后WB作為IgG TrueBlot?的陽性對照。

　　(4) 陰性對照：WB過程中不加一抗，直接加二抗TrueBlot? beads。

　　(5) SDS-PAGE電泳及WB：Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot?檢測過程為用含適量抗氧化劑上樣液電泳，然后Poncean S預染和20%的乙酸/30%甲醇脫色；再室溫自然晾干1小時，用含甲醇的Buffer A潤膜后封閉。這個操作過程可以得到很好的WB結果，PVDF膜或硝酸纖維膜都適用于此檢測過程。

　　4）.相關緩沖液配方：

　　2X SDS Reducing Sample Loading Buffer (包含50 mM DTT)

　　950 mL 2X SDS sample buffer

　　50 mL 1M DTT

　　注: 1小時內(nèi)使用，過期丟棄。.

　　2X SDS Sample Buffer

　　6% SDS

　　25mM Tris base pHed to 6.5 with HCl

　　10% glycerol

　　Bromphenol blue

　　注: -20°C長時間儲存 ，室溫最多只能儲存一月。

　　TBS-Tween (TBS-T):

　　25 mM Tris-HCl, pH 8.0

　　125 mM NaCl

　　0.1% Tween 20

　　Blocking Buffer:

　　5g 脫脂奶粉

　　100ml TBS-T

　　調整PH值為7.4

　　Antibody Binding Buffer:

　　 含1% 脫脂奶粉 TBS-T

　　Protease Inhibitor Cocktail (100X):

　　PMSF, 5mg (50μg/ml)

　　Aprotinin, 100μg (1μg/ml)

　　Leupeptin, 100μg (1μg/ml)

　　Pepstatin, 100μg (1μg/ml)

　　Phosphatase Inhibitor (100X):

　　1mM Na3VO4

　　1mM NaF

　　注： IP: Immunoprecitaton免疫共沉淀. WB: Western Blot蛋白質印記

參考文獻：

1. Alegria-Schaffer A, Lodge A, Vattem K. 2009. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods Enzymol. 2009;463:573-99.

2. Haan C, Behrmann I. 2007. A cost effective non-commercial ECL-solution for Western blot detections yielding strong signals and low background. J Immunol Methods. Jan 10;318(1-2):11-9.

3. Immunoblot affinity purification. 2005. Nature Methods 2, 797 – 798.

4. Uhlig U, Uhlig S, Branscheid D, Zabel P, Vollmer E, Goldmann T. 2004. HOPE technique enables Western blot analysis from paraffin-embedded tissues. Pathol Res Pract. 2004;200(6):469-72.

5. Wu M, Stockley PG, Martin WJ 2nd. 2002. An improved western blotting technique effectively reduces background. Electrophoresis. Aug;23(15):2373-6.