一、說(shuō)明

HIV整合酶可以將HIV DNA整合入宿主細(xì)胞DNA，因此，整合酶成為艾滋病研究的潛在靶標(biāo)。

按照實(shí)驗(yàn)方案，向預(yù)包被鏈霉親和素的96孔板依次加入：

　a)DS DNA（double-stranded HIV-1 LTR U5 donor substrate DNA，末端生物素標(biāo)記）

　b)全長(zhǎng)的重組HIV-1整合酶

　c)抑制劑或?qū)嶒?yàn)樣品

　d)TS DNA（double-stranded target substrate，3’-末端修飾）

　e)TMB 底物

　f)終止液

催化反應(yīng)：HIV-1整合酶催化從DS DNA向TS DNA的核酸鏈轉(zhuǎn)移重組反應(yīng)

檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物：加入HRP-標(biāo)記的抗體 + TMB底物

二、試劑盒組分

★ 在上述儲(chǔ)存條件下，試劑盒可以穩(wěn)定保持1年。

★ 打開(kāi)箔片包裝袋后，本次實(shí)驗(yàn)未使用的微孔板條須密封好，放回箔片包裝袋中，儲(chǔ)存于2~8℃。

★ 實(shí)驗(yàn)之前，反應(yīng)緩沖液（2 ml /孔）應(yīng)該添加14.5 M β-巰基乙醇（BME 0.4 μl/1 ml）激活。BME激活的反應(yīng)緩沖液可以在2~8℃穩(wěn)定保持1周。儲(chǔ)存期間，反應(yīng)緩沖液可能出現(xiàn)沉淀，所以使用之前，反應(yīng)緩沖液可以 37℃水浴。

三、實(shí)驗(yàn)前注意事項(xiàng)

一般建議：

開(kāi)始試驗(yàn)之前，請(qǐng)仔細(xì)閱讀操作方案，因?yàn)榧?xì)微的差錯(cuò)就會(huì)影響最終結(jié)果。為了得到優(yōu)良的結(jié)果，請(qǐng)優(yōu)先使用板內(nèi)部的、近中心的孔。z

配置洗液：

提供的是20×，使用之前，混勻50 ml 濃縮洗液 + 950 ml滅菌蒸餾水，稀釋至1×。

反應(yīng)緩沖液：

該緩沖液含有錳、鎂。使用之前，添加0.4 μl/1 ml 2-ME激活。每孔需要使用反應(yīng)緩沖液 2 ml。只激活本次實(shí)驗(yàn)使用的這一份反應(yīng)緩沖液，而不要把整瓶220 ml 反應(yīng)緩沖液一次全部激活。取用之前，輕輕把瓶子搖勻。

DS and TS DNAs：

提供的是100×。使用之前，用反應(yīng)緩沖液稀釋100倍至1×。TS DNA易于粘附離心管壁。

HIV-1 整合酶：

每次使用之前置于冰上解凍，保證酶的穩(wěn)定。

洗板：

可以人工洗，也可以用自動(dòng)洗板機(jī)洗。每次洗后，輕輕拍打，完全除去孔內(nèi)的殘液。

復(fù)孔：

建議所有樣品和對(duì)照都做2~3個(gè)重復(fù)。

四、操作流程

DS 包被 和 SA 板封閉

1. 復(fù)溫：

實(shí)驗(yàn)之前，反應(yīng)緩沖液、封閉液 37℃水浴10 min。除了HIV-1 整合酶（置于冰上解凍），其余試劑都復(fù)溫至室溫。

2. 包被DS DNA

本次未使用的板條重新密封好，放回箔片包裝袋。用反應(yīng)緩沖液稀釋本次使用的DS DNA至1×（10 μl DS DNA 100× 溶液 + 990 μl 反應(yīng)緩沖液）。每孔加入100 ml 1× DS DNA，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min。反應(yīng)緩沖液放回37℃水浴。

3. 封閉

吸去孔內(nèi)液體，用300 μl 1× 洗液洗5次。每孔加入200 μl 封閉液，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min。

如果需要，板可以置于2~8℃過(guò)夜，在稍晚接著方案做實(shí)驗(yàn)之前，37℃培養(yǎng)箱孵育20 min即可。但是如果在一天之內(nèi)連續(xù)做完，實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)更好。

整合酶反應(yīng)

4.將整合酶加入 DS DNA孔

使用之前，HIV-1 整合酶置于冰上或2~8℃解凍（大約5 min），快速離心管子（例如10000 RPM × 5 sec）。用反應(yīng)緩沖液以1︰300稀釋（2 μl HIV-1 整合酶 + 598 μl 反應(yīng)緩沖液）。吸去孔內(nèi)液體，用200 μl 反應(yīng)緩沖液洗3次。每孔加入100 μl 反應(yīng)緩沖液（陰性對(duì)照）或整合酶溶液（陽(yáng)性對(duì)照），37℃培養(yǎng)箱孵育30 min。反應(yīng)緩沖液放回37℃水浴。

5. 加抑制劑和檢測(cè)物

制備實(shí)驗(yàn)樣品：用反應(yīng)緩沖液稀釋至2×最終要求的實(shí)驗(yàn)樣品濃度。例如，當(dāng)實(shí)驗(yàn)要求的樣品最高濃度是10 μM或10 μg/ml時(shí)，用反應(yīng)緩沖液制備20 μM或20 μg/ml的樣品，以及系列稀釋。疊氮鈉稀釋至0.30%（2×濃度或0.15%最終1×濃度），抑制大約50%整合酶活性。

吸去孔內(nèi)液體，用200 μl 反應(yīng)緩沖液洗3次。每孔加入50 μl對(duì)照，或用反應(yīng)緩沖液制備的50 μl 實(shí)驗(yàn)樣品（negative control）或整合酶溶液（positive control），室溫孵育5 min。

6. 加入 TS DNA

用反應(yīng)緩沖液稀釋本次使用的TS DNA至1×（10 μl TS DNA 100× 溶液 + 990 μl 反應(yīng)緩沖液）。每孔直接加入50 ml 1× TS DNA。輕輕敲打以混勻。37℃孵育30 min。

檢測(cè)反應(yīng)

7. 加 HRP-抗體

吸去孔內(nèi)液體，用300 μl 洗液洗5次。每孔加入100 μl HRP 抗體，37℃孵育30 min。

8. 加入TMB 底物

吸去孔內(nèi)液體，用300 μl 洗液洗5次。每孔加入100 μl TMB 過(guò)氧化物酶底物 溶液，室溫孵育10 min。

9. 加入 TMB 終止液

孔中直接加入100 μl TMB 終止液。用槍頭弄破任何較大的氣泡。用讀板機(jī)以最小0.1 sec讀取450 nm處吸光度。加入TMB 終止液后，應(yīng)該在10 min內(nèi)讀板。

如果OD450吸光度超過(guò)了讀板機(jī)的范圍，為了實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的讀數(shù)和數(shù)值終點(diǎn)，可以將反應(yīng)物稀釋。將100 μl 反應(yīng)液 + 100 μl 去離子水加入稀釋板（無(wú) SA-coated），讀取450 nm處吸光度。此稀釋樣品的吸光值應(yīng)該乘以2。