T細(xì)胞體外活化
方案A: 刺激活化小鼠外周T細(xì)胞方案。
方案B：刺激活化人PBMC方案。
方案A: 刺激活化小鼠外周T細(xì)胞方案
1、材料
1×PBS無菌
Anti-mouse CD3e, Clone 145-2C11 (Functional Grade, Cat. No. 16-0031, or Purified, Cat. No. 14-0031) Anti-mouse CD28, Clone 37.51 (Functional Grade, Cat. No. 16-0281)
RPMI1640完全培養(yǎng)基：
900 mL RPMI-1640 (Hyclone Cat. No. SH30027.02)
100 mL FBS (Hyclone Cat. No. SH30151.03) Heat inactivated (10% final)
1 mL 2-mercaptoethanol (Gibco BRL Cat. No. 21985-023)
10 mL L-Glutamine (Hyclone Cat. No. SH30034.01)
Antibiotic cocktail (可選)
小鼠脾臟或淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液（無菌）
帶蓋的無菌96孔培養(yǎng)板（Costar Cat. No. 3596）
刀豆蛋白A（ConA, Sigma Cat. No. C5275）
2、儀器
吸管和移液器
37度CO2培養(yǎng)箱
臺式低溫離心機(jī)
3、實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間
包被抗體時(shí)間：2-18小時(shí)
制備脾臟單細(xì)胞懸液時(shí)間：20分鐘
處理細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間：20分鐘
培養(yǎng)時(shí)間：2-4天
4、實(shí)驗(yàn)方案
1）抗體預(yù)包被：
(1) 用無菌PBS配制5-10ug/ml 的CD3e抗體溶液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和復(fù)孔的數(shù)目計(jì)算所需抗體工作液的量。例如包被48孔，則需要抗體體積為2.6ml。
(2) 每孔加CD3e抗體溶液50ul，空白孔加PBS。
(3) 蓋板，四度孵育過夜或37度孵育2小時(shí)。
(4) 除去抗體溶液，無菌PBS洗滌2次，即可加細(xì)胞懸液。
2）添加細(xì)胞：
(1) 取小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸液，按照方案除去紅細(xì)胞。 (2) 完全培養(yǎng)基定容細(xì)胞為106/ml（該密度是TCR介導(dǎo)T細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)的最佳濃度；亦可依據(jù)自己實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)摸索最佳濃度）。
(3) 每孔加200ul細(xì)胞懸液（可加1-4ug/ml，ConA刺激）。
(4) 加入可溶性的CD28抗體，2ug/ml。
(5) 37°C, 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-4天，具體增殖的最佳時(shí)間依賴實(shí)驗(yàn)者摸索。
(6) 收獲細(xì)胞，繼續(xù)其他方面的實(shí)驗(yàn)。
方案B：刺激活化人PBMC方案
1、材料
1×PBS無菌
Anti-human CD3e, Clone OKT3Functional Grade, Cat. No. 16-0037, or Clone HIT3a, Cat. No. 16-0039)
Anti-human CD28, Clone 28.2 (Functional Grade, Cat. No. 16-0289)
RPMI1640完全培養(yǎng)基：
900 mL RPMI-1640 (Hyclone Cat. No. SH30027.02)
100 mL FBS (Hyclone Cat. No. SH30151.03) Heat inactivated (10% final)
1 mL 2-mercaptoethanol (Gibco BRL Cat. No. 21985-023)
10 mL L-Glutamine (Hyclone Cat. No. SH30034.01)
Antibiotic cocktail (可選)
無菌PBMC細(xì)胞懸液
帶蓋的無菌96孔培養(yǎng)板（Costar Cat. No. 3596）
2、儀器
吸管和移液器
37度CO2培養(yǎng)箱
臺式低溫離心機(jī)
3、持續(xù)時(shí)間
包被抗體時(shí)間：2-18小時(shí)
制備脾臟單細(xì)胞懸液時(shí)間：30分鐘
處理細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間：20分鐘
培養(yǎng)時(shí)間：2-4天
4、實(shí)驗(yàn)步驟
1）抗體預(yù)包被：
(1) 用無菌PBS配制5-10ug/ml 的CD3e抗體溶液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和復(fù)孔的數(shù)目計(jì)算所需抗體工作液的量。例如包被48孔，則需要抗體體積為2.6ml。
(2) 每孔加CD3e抗體溶液50ul，空白孔加PBS。
(3) 蓋板，四度孵育過夜或37度孵育2小時(shí)。
(4) 除去抗體溶液，無菌PBS洗滌2次，即可加細(xì)胞懸液。
2）添加細(xì)胞：
(1) 提取人類PBMC單細(xì)胞懸液。
(2) 完全培養(yǎng)基定容細(xì)胞為106/ml（該密度是TCR介導(dǎo)T細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)的最佳濃度；亦可依據(jù)自己實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)摸索最佳濃度）。
(3) 每孔加200ul細(xì)胞懸液（可加1-4ug/ml，ConA刺激）。
(4) 加入可溶性的CD28抗體，2ug/ml。
(5) 37°C, 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-4天，具體增殖的最佳時(shí)間依賴實(shí)驗(yàn)者摸索。
(6) 收獲細(xì)胞，繼續(xù)其他方面的實(shí)驗(yàn)。
