1、材料

L-929 細(xì)胞系（ATCC Cat# CCL-1）或A549 人類肺癌細(xì)胞（ATCC Cat# CCL-185）

培養(yǎng)基：RPMI1640+10%FBS。

檢測(cè)培養(yǎng)基：RPMI1640+2%FBS。

96孔板（平底）（Costar Cat.No.3595）

EMC病毒（腦心肌炎病毒），107pfu/ml 等分-80度凍存（避光）。

MTT溶液：（Sigma Cat. No. M5655）5mg/ml 儲(chǔ)液（PBS稀釋），室溫避光保存。

MTT裂解液：20%SDS或50%DMF。

2、儀器

吸管和移液器

恒濕培養(yǎng)箱

96孔微孔檢測(cè)分光光度計(jì)

3、持續(xù)時(shí)間

孵育時(shí)間24小時(shí)

測(cè)定樣品準(zhǔn)備時(shí)間1小時(shí)

4、實(shí)驗(yàn)步驟

(1) 使用檢測(cè)培養(yǎng)基制備L929或A459懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3.5×105/ml，每孔加100ul細(xì)胞懸液。37度 5%CO2 恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。

(2) 另一塊稀釋板中每孔加50ul檢測(cè)培養(yǎng)基。

(3) 使用兩倍的連續(xù)稀釋液從第3排到第12排依次稀釋功能級(jí)別的抗細(xì)胞因子抗體（見(jiàn)速查表標(biāo)準(zhǔn)范圍），留1,2排不加。

(4) 2排到12排每孔加50ul重組細(xì)胞因子和樣品（濃度見(jiàn)速查表，第二排是細(xì)胞因子和指示細(xì)胞組），1排是只有細(xì)胞的對(duì)照組。

(5) 37度 5%CO2 恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)。

(6) 將50ul的抗原抗體混合液加到包含細(xì)胞的對(duì)應(yīng)孔中。

(7) 孵育6小時(shí)。

(8) 小心棄上清，加100ul EMC病毒液調(diào)整密度為1-4×104pfu/ml（人類IFN-γ 1:20稀釋病毒儲(chǔ)液；而小鼠IFN-γ 1:1000稀釋病毒儲(chǔ)液）

(9) 37度 5%CO2 恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)40小時(shí)。

(10)每孔加10ul MTT溶液（5mg/ml），孵育4小時(shí)。

(11)每孔加50ul MTT 裂解液，孵育過(guò)夜。

(12)570-650nm 讀板。

(13)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線分析數(shù)據(jù)。