無染色

一抗和二抗不匹配

使用針對一抗的二抗（如一抗來自兔，二抗為抗兔抗體）

沒有足夠的一抗與目標蛋白結合

使用低稀釋度抗體。延長4℃孵育時間（如過夜）。

抗體的天然結構（3D形態(tài)）受損不適用于IHC

用天然（非變性的）WB法檢測抗體，確?？贵w沒被損壞。

由于不當儲存、稀釋或反復凍融造成一抗/二抗試劑盒失效

做陽性對照確認一抗/二抗試劑盒的有效性。

靶組織中沒有目標蛋白

參照抗體供應商的建議做陽性對照。

組織中沒有足夠的目標蛋白

應用信號放大操作。

沒有避光保存二抗

避免將二抗處于光照下

脫蠟不徹底

延長脫蠟時間，更換二甲苯。

固定步驟（使用福爾馬林和多聚甲醛固定劑）修飾了抗體識別表位

抗原修復法暴露出抗原表位，縮短固定時間。

蛋白位于細胞核內（核蛋白），抗體不能穿透核膜

在封閉液和抗體稀釋液中加入通透劑。

PBS緩沖液被細菌污染后破壞了靶蛋白的磷酸根

在抗體PBS儲存液中加入0.01%疊氮化合物，或使用新鮮無菌的PBS。

高背景

沒有封閉非特異性結合或封閉不充分

延長封閉時間，并考慮改換封閉劑。建議用10%正常血清封閉切片1小時或1-5% BSA封閉培養(yǎng)細胞30分鐘。

一抗?jié)舛冗^高

滴定法尋找到最佳抗體濃度，或在濃度較低抗體中延長孵育時間（最好是緩慢而準確地結合）。

孵育溫度過高

4°C孵育切片或細胞。

二抗發(fā)生了非特異性結合（被損壞）

不加一抗，做二抗對照。

組織沖洗不徹底，有固定劑殘留

所有步驟都要用PBS充分洗滌。

存在內源性過氧化物酶活性

用酶抑制劑如抑制堿性磷酸酶的鹽酸左旋咪唑(2mM)，或抑制過氧化物酶的H2O2(0.3% v/v)。

固定過度（固定劑用福爾馬林和多聚甲醛）導致抗體識別抗原位點被修飾

改變抗原修復方法，縮短與抗原修復液的孵育時間。

信號過度放大（信號放大技術）

縮短信號放大孵育時間，稀釋信號擴大試劑盒。

染料與PBS在細胞/組織中相互作用（酶檢測法）

用Tris緩沖液沖洗切片后，再與底物孵育。孵育后，Tris緩沖液再次沖洗細胞/切片。

通透作用破壞膜并除去了膜蛋白

去除緩沖液中的通透劑

底物過量（酶檢測法）

縮短底物孵育時間

非特異性染色

一抗/二抗?jié)舛冗^高

降低抗體濃度和或縮短孵育周期。對比不表達目標蛋白細胞的信號強度。

存在內源性過氧化物酶活性

用酶抑制劑如抑制堿性磷酸酶的鹽酸左旋咪唑(2mM)，或抑制過氧化物酶的H2O2(0.3% v/v)。

一抗與被染組織同源(如用鼠一抗測鼠組織)，加二抗后，二抗會與同源的所有組織結合

應用與組織非同源的一抗

切片/細胞變干

保持切片/細胞濕度，切勿變干。