做過PCR的童鞋們都知道要想完全hold該實(shí)驗(yàn)、成為真正的PCR達(dá)人，并非易事。就qPCR而言，似乎其中的每一環(huán)節(jié)都可以讓整個(gè)實(shí)驗(yàn)掛掉，也因此成為了資深科研狗們心中的痛。有時(shí)，各種假陽(yáng)性、非特異性帶等問題就是揮之不去、不請(qǐng)自來，這個(gè)時(shí)候該如何是好呢？實(shí)踐出真知，小魚就將各位前輩用經(jīng)驗(yàn)換來的真理分享給大家。

普通PCR常見問題

Q1：PCR產(chǎn)物出現(xiàn)假陽(yáng)性（即空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物）

Answer：

1.引物設(shè)計(jì)不合適：擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，PCR也可擴(kuò)增出非靶序列的序列；靶序列太短或引物太短，可導(dǎo)致假陽(yáng)性。此時(shí)需重新設(shè)計(jì)引物。

2.為了避免靶序列受到整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；除了酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑及器材應(yīng)高溫滅菌，所有離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用；必要時(shí)，加樣前反應(yīng)管和試劑均用紫外線照射，以破壞存在的核酸；

3.為了避免靶基因受到空氣中小片段核酸（與靶序列具有一定同源性）污染，可用巣式PCR方法減輕或消除。

Q2：PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)假陰性或無擴(kuò)增產(chǎn)物（即陽(yáng)性對(duì)照中有條帶，而樣品則無條帶）

Answer:

1.條帶放置時(shí)間過久,核酸被降解，最好在48h內(nèi)進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2.DNA模板純度低，如含有雜蛋白質(zhì)或Taq酶抑制劑，可對(duì)DNA進(jìn)行再次純化或重新用優(yōu)質(zhì)試劑盒提取DNA; DNA濃度太低時(shí)，可以加大模板量；對(duì)具有二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA使用較好的聚合酶；提取DNA時(shí)，避免吸入酚類試劑。

3.對(duì)設(shè)計(jì)不合理的引物進(jìn)行重新設(shè)計(jì)合成；引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融而降解失效；檢測(cè)引物OD值并進(jìn)行電泳檢測(cè)以確保兩條引物濃度一致。

4.酶失活時(shí)，更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。

5.PCR反應(yīng)條件：提高變性/退火溫度；適當(dāng)增加循環(huán)次數(shù)。

6.Mg2+濃度過低可影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗，而Mg2+濃度過高會(huì)降低PCR的特異性，因而可適當(dāng)提高M(jìn)g2+濃度。

7.如果靶序列發(fā)生突變或缺失時(shí)，也會(huì)影響引物和模板的特異性結(jié)合，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

Q3：非特異性條帶擴(kuò)增或者條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象

Answer：

1.當(dāng)引物特異性差或引物形成二聚體時(shí)，可重新設(shè)計(jì)引物或者使用巣式PCR

2.若模板或引物濃度過高，可適當(dāng)降低模板或引物濃度

3.酶量過多，則適當(dāng)減少酶量

4.Mg2+濃度偏高，則降低鎂離子濃度

5.退火溫度偏低，適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法（94℃變性，65℃左右退火與延伸）

6.循環(huán)次數(shù)過多，不僅會(huì)降低擴(kuò)增效率，且會(huì)使錯(cuò)誤摻入率增加，因此需要減少循環(huán)次數(shù)。

Q4：提高PCR特異性的策略有哪些？

Answer:

四種策略：

1.巣式PCR（Nest-PCR）可增加稀有靶序列的靈敏度；降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性；提高PCR特異性

2.遞減PCR（Touch Down PCR）：前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性；循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個(gè)循環(huán)降低1-2℃，直到退火溫度低于Tm 5℃ 。適合用于AFLP、DNA指紋分析等。

3.熱啟動(dòng)PCR：抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀到達(dá)變性溫度。如在冰上配制PCR反應(yīng)液以抑制Taq酶活性，后將其置于預(yù)熱的PCR儀中。

4.使用PCR增強(qiáng)劑：甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等可以降低熔解溫度，有助于引物退火，輔助DNA聚合酶延伸通過二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。但是增強(qiáng)劑的濃度要適當(dāng)。

Q5:PCR引物設(shè)計(jì)的一般原則是什么？

Answer：

1.引物長(zhǎng)度：15-30bp,一般為20bp左右。

2.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。上下游引物的GC含量不能相差太大。A/T/C/G最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

3.引物結(jié)構(gòu)：避免引物3’端出現(xiàn)互補(bǔ)序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)，3’端的堿基特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)。

4.引物中酶切位點(diǎn)一般加在5’端，合適的酶切位點(diǎn)便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶切分析或分子克隆。

5.引物濃度：每條引物濃度0.1-1umol或10-100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物間二聚體的形成機(jī)會(huì)。

（回復(fù)“引物”，可查看引物設(shè)計(jì)實(shí)例教程）

Q6：克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？

Answer:

目的片段與載體的最佳比例需依照實(shí)驗(yàn)來確定，一般1:1為最佳比，摩爾數(shù)比為1:8或8:1也行。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶及目的片段共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4℃過夜（可提高鏈接效率）。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。

Q7：PCR產(chǎn)物是否需要凝膠純化？

Answer:

如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物中只有一條帶，則無需凝膠純化。若是有大量的引物二聚體，則需在克隆前進(jìn)行凝膠純化。

Q8：沒有回收到目的片段，需要做什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？

Answer:

1.涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，如有菌落，表明氨芐霉素失效，或有氨芐抗性的雜菌污染。

2.轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化率=產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA總量，鋪板DNA總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。例如將1ul的質(zhì)粒（1ug/ul）用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。再將1ul轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞稀釋至1000ul后（含有10ng DNA），用100ul鋪板（含有1ng DNA）。過夜培養(yǎng)后得到了1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率=1000菌落數(shù)×103ng/鋪板1ng DNA=106 cfu/ug。低于108cfu/ug，轉(zhuǎn)化效率低，應(yīng)重新進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

3.如用pGEM-T作為陽(yáng)性對(duì)照，產(chǎn)生了超過20-40個(gè)藍(lán)斑，表明載體失去T?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶，需更換核酸酶。

Q9：對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問題？

Answer:

1.目的片段不適合連接。因用凝膠純化的目的片段在受到UV過度照射時(shí)會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必須重新純化。

2.如PCR反應(yīng)體系的DNA聚合酶若帶有修復(fù)功能，則擴(kuò)增產(chǎn)物末端無堿基A（該堿基是pGEM-T載體克隆所需的）。可將酶更換為Taq DNA聚合酶。

3.高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定，在PCR擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排。如若目的片段高頻率的產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞。

qPCR的疑難雜問

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Q10：如何提高RT-PCR反應(yīng)的靈敏度與特異性？

Answer:

1.首先確定模板RNA完整性好，無DNA污染。

2.RNA模板中不應(yīng)含有擴(kuò)增反應(yīng)抑制劑

3.為了防止模板降解，在反應(yīng)體系中加入RNase抑制劑RNasin。

4.使用適量的模板RNA，模板量太多會(huì)降低特異性，太少會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增不出條帶或條帶太弱。

5.若模板中有二級(jí)結(jié)構(gòu)，可通過提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度來提高擴(kuò)增效果。

6.設(shè)計(jì)引物時(shí)，避免在引物3’端含有互補(bǔ)序列，避免形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

Q11：避免RNA降解的方法有哪些？

Answer:

1.在用來驗(yàn)證完整性之前先在變性膠上分析RNA

2.使用良好無污染技術(shù)分離RNA

3.將組織從動(dòng)物體取出后立刻提取RNA，并將提取好的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行低溫保存。

Q12:RNA中含有逆轉(zhuǎn)錄抑制劑時(shí)，怎么處理？

Answer:

逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽，可將對(duì)照RNA同樣品混合，同對(duì)照RNA反應(yīng)比較產(chǎn)量以檢測(cè)RNA抑制劑；若對(duì)照RNA與樣品混合后產(chǎn)量降低，則說明樣品中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑，可用70%（v/v）乙醇對(duì)RNA沉淀進(jìn)行清洗，以除去抑制劑。

Q13：如何解決合成cDNA第一鏈合成的引物退火不充分？

Answer:

確定退火溫度適合實(shí)驗(yàn)中所用的引物。如隨機(jī)六聚體，建議在反應(yīng)溫度保溫之前先在25℃保溫10min。

Q14：如何減少RNA模板中的二級(jí)結(jié)構(gòu)？

Answer:

1.將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性、退火；提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度。

2.溫度超過60℃時(shí)，不能使用oligo（dT）引物，選擇一個(gè)在反應(yīng)溫度可以退火的GSP

3.RT-PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度超過1kb時(shí)，反應(yīng)溫度需保持在65℃。

Q15：RNA中有DNA污染的處理方式

Answer：

1.若是基因組DNA的污染，可使用DNaseI處理RNA; 同時(shí)設(shè)置沒有逆轉(zhuǎn)錄的對(duì)照組反應(yīng)檢測(cè)DNA污染。

2.若是受到外源DNA的污染，可使用抗氣霧劑和UDG酶。

Q16：qPCR探針設(shè)計(jì)的一般原則有哪些？

Answer:

1.擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度不應(yīng)太大，一般小于300bp。

2.探針不能和任一引物互補(bǔ)，且其長(zhǎng)度在保證特異性的前提下盡可能的短，長(zhǎng)度不要超過30bp。

3.探針的Tm值至少比引物的Tm值高5度

4.探針如用于檢測(cè)多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)應(yīng)盡可能靠近探針中部

5.探針5’端不能是堿基G，G對(duì)熒光基團(tuán)有猝滅作用。

Q17：在無反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對(duì)照RNA仍獲得擴(kuò)增結(jié)果

Answer：

1.體外轉(zhuǎn)錄時(shí)不可能將所有DNA模板消除，因而對(duì)照組會(huì)含有痕量的DNA。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染造成的影響。

2.可能是引物二聚體的條帶。

Q18：擴(kuò)增產(chǎn)物滯留在加樣孔中

Answer：

1.可能是由于模板量過高而導(dǎo)致PCR結(jié)果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。建議將第一鏈cDNA濃度稀釋至100倍再進(jìn)行二次擴(kuò)增。

2.在二次PCR時(shí)，使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可將退火溫度適當(dāng)增高或進(jìn)行熱啟動(dòng)以提高特異性。

Q19：無Ct信號(hào)出現(xiàn)

Answer：

1.反應(yīng)循環(huán)參數(shù)不夠，一般要在35個(gè)循環(huán)以上，但是過多的循環(huán)次數(shù)可增加背景值。

2.檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。SYBRgreen法（SG法）采用的是72℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)，taqman法則是在退火結(jié)束或延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行信號(hào)采集。

3.引物或探針降解，可用PAGE電泳檢測(cè)其完整性，若是電泳條帶呈彌散狀，可考慮重新合成引物或探針。

4.模板不足或降解，則可以重新提取核酸模板。

Q20：Ct值出現(xiàn)過晚（Ct>38）

Answer：

1.擴(kuò)增效率低，反應(yīng)條件不夠優(yōu)化，降低退火溫度，增加鎂離子濃度。

2.反應(yīng)成分降解或加樣量不足

3.PCR產(chǎn)物過長(zhǎng)，一般采用80-150bp.

Q21：標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳

Answer：

1.加樣存在誤差，是樣品濃度不成梯度。

2.標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解，避免反復(fù)凍融。

3.引物或者探針設(shè)計(jì)不佳。

4.模板中存在抑制物或模板濃度過高。

Q22：溶解曲線存在多個(gè)主峰

Answer：

1.引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。

2.引物濃度不佳，上下游引物濃度比例不一致。

3.鎂離子濃度過高。

4.模板基因組的污染。

Q23：同一樣品中，其中某一個(gè)熒光信號(hào)特別強(qiáng)。

Answer:

1.試劑配制時(shí)反應(yīng)液沒有完全溶化，導(dǎo)致探針量在一管增多。

2.試劑配制時(shí)沒有充分混勻致各管中各成分的量不同。

3.PCR儀熱槽被熒光物質(zhì)污染，需要清除熱槽中的污染。

Q24：擴(kuò)增曲線有一向上或向下的尖峰？

Answer：

1.反應(yīng)過程中電壓不穩(wěn)定

2.可能在20個(gè)循環(huán)左右時(shí)，儀器有停下或儀器有開蓋，使光線突然增強(qiáng)

3.如果尖峰向下，可能是由鹵素?zé)衾匣拢@時(shí)應(yīng)更換。

Q25：部分樣本擴(kuò)增效率過低？

Answer:

1.提取液殘留，一定程度抑制了PCR反應(yīng)

2.反應(yīng)液未嚴(yán)格取量混勻或分裝不均勻

3.試劑失效

Q26：陰性對(duì)照或空白對(duì)照翹尾

Answer：

1.模板提取環(huán)境或操作過程有污染

2.配液過程存在污染

Q27：直線型擴(kuò)增曲線

Answer：

1.探針部分降解：一般稀釋的探針可在4°C保存至少3個(gè)月，探針的反復(fù)凍融或?qū)е陆到猓换蛘咛结樤诠饩€下暴露時(shí)間太長(zhǎng)了。

2.反應(yīng)液中有PCR抑制物。 

Q28：沒有擴(kuò)增曲線

Answer：

1.PCR參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤，在設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)時(shí)將熒光信號(hào)讀取時(shí)間設(shè)在反應(yīng)的第一步，即stage1階段

2.電腦設(shè)定了自動(dòng)休眠

Q29：基線下滑

Answer：

基線選取范圍不對(duì)，可試著將基線范圍改大一些，這一問題常因試劑質(zhì)量所致。

Q30：擴(kuò)增曲線斷裂

Answer：

基線選取范圍不對(duì)，基線終點(diǎn)大于Ct值，這通常是由于模板DNA濃度過高所致，因Ct值<15，而基線范圍仍取3-15，其中包含部分?jǐn)U增信號(hào)，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差偏大，閾值過高，解決辦法：減少基線終點(diǎn)至Ct前4個(gè)循環(huán)，重新分析數(shù)據(jù)。

Q31：樣品濃度跨度過大

Answer：

樣品濃度過高，導(dǎo)致陽(yáng)性樣品擴(kuò)增曲線在后面循環(huán)中呈一向下的直線，其解決方法同“擴(kuò)增曲線斷裂”。

Q32：山坡形曲線

Answer：

常因反應(yīng)管封口不嚴(yán)，至反應(yīng)液蒸發(fā)所致