PeproTech細(xì)胞因子溶解稀釋方法

一、查看說明書

1.確定合適的溶解液

收到產(chǎn)品后，首先應(yīng)查看說明書中細(xì)胞因子儲(chǔ)存和處理的方法。見下圖：

2.確定合適的溫度

二、溶解

1.離心

收到的管子內(nèi)為凍干粉，開蓋前要快速離心10000-12000rpmx30s。

2.溶解

根據(jù)說明書紅色標(biāo)識(shí)地方的描述，選擇合適的溶解液，溶解到后邊的濃度范圍內(nèi)。如此可以確保蛋白充分溶解復(fù)性，保證產(chǎn)品質(zhì)量。請(qǐng)不要使用非建議溶液溶解。

目的：使細(xì)胞因子從無活性的凍干粉狀態(tài)充分溶解復(fù)性成為有活性的蛋白溶液。

注意：不要用渦旋振蕩儀劇烈渦旋，可以用槍頭輕輕吹打幾次助溶。有的細(xì)胞因子溶解比較慢，需要在室溫靜置或者搖床低速搖一段時(shí)間使充分溶解。溶解緩沖液的配方參考微信公眾號(hào)->實(shí)用工具->蛋白溶解液配制。

3.短期儲(chǔ)存

溶解后的蛋白溶液可以在2-8度儲(chǔ)存1周。

4.長期儲(chǔ)存

如果您的實(shí)驗(yàn)，一周內(nèi)不能用完。必須將第2步中獲得的溶液用含載體蛋白的溶液進(jìn)一步稀釋。(詳見：三、稀釋)

目的：對(duì)溶解一步的蛋白溶液進(jìn)行稀釋凍存。加入載體蛋白可以封閉掉管壁上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，且可以在低溫下維持細(xì)胞因子的穩(wěn)定。

三、稀釋

1.配制

配制0.1%BSA或者10%FBS或者5%海藻糖備用(確保無菌)，這三種稀釋液的配制的Buffer可以用PBS或者細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。使用以上三種稀釋液的任意一種稀釋重懸的蛋白溶液，稀釋濃度根據(jù)您的使用濃度確定，不要低于10ug/ml。即可分裝成小管，凍存在-20--80度。

2.使用方法

使用時(shí)取用一支凍存的細(xì)胞因子，加入到您的培養(yǎng)基中至使用濃度。細(xì)胞因子應(yīng)避免反復(fù)凍融。

四．你問我答

1.為什么會(huì)有這么多種溶解方法？

蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是pH值和離子強(qiáng)度。PeproTech的細(xì)胞因子或重組蛋白在出廠前均經(jīng)嚴(yán)格測(cè)試，說明書上所標(biāo)明的溶解液是能夠?qū)⒃摷?xì)胞因子或重組蛋白完全溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強(qiáng)度與說明書中所標(biāo)明的不符，很多時(shí)候會(huì)造成細(xì)胞因子或重組蛋白不能完全溶解或者根本無法溶解，這樣所配得的細(xì)胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。

2.沒有看說明書的習(xí)慣，直接用PBS或培養(yǎng)液(1640或DMEM等)等溶解細(xì)胞因子或蛋白的凍干粉。這樣做可以嗎？

有時(shí)可以，要看具體情況。PeproTech的大多數(shù)細(xì)胞因子或蛋白凍干粉的溶解液不是PBS，此時(shí)千萬不能用PBS或培養(yǎng)液直接來溶解，具體原因在上面已經(jīng)敘述過。而有部分細(xì)胞因子，如重組人KGF(產(chǎn)品編號(hào)：100-19)和重組人FGF-23(產(chǎn)品編號(hào)：100-52)等，說明書上的溶解液即為1x PBS，此時(shí)用PBS溶解完全沒問題，那么用培養(yǎng)液溶解也是可以的，不過最好還是用先用PBS溶解，然后再用培養(yǎng)液稀釋。

3.高于或低于該濃度范圍會(huì)有什么問題呢？

首先，細(xì)胞因子或蛋白會(huì)不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個(gè)濃度范圍，可能會(huì)超過該蛋白的最大溶解濃度，即蛋白無法完全溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會(huì)出現(xiàn)聚集(aggregation)，最終結(jié)果還是部分蛋白未溶解，導(dǎo)致蛋白活性的減弱。

4.若想保證溶解液與凍干粉充分混勻，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子或重組蛋白的完全溶解，該怎么辦呢？

多數(shù)細(xì)胞因子或重組蛋白的凍干粉是非常容易溶解的，一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下，即可使細(xì)胞因子或重組蛋白完全溶解。對(duì)于不易溶解的細(xì)胞因子或蛋白，PeproTech會(huì)在說明書中進(jìn)行備注(Note)。如在重組人IL-13(產(chǎn)品編號(hào)：200-13)的說明書中您會(huì)看到：Slow to dissolve (緩慢溶解)，在重組人IL-11(產(chǎn)品編號(hào)：200-11)的說明中會(huì)看到： This solution is slow to dissolve(該溶液溶解緩慢)。這種情況下，您最好能將要溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白放在水平搖床(shaker)上低速搖一段時(shí)間，促使細(xì)胞因子或重組蛋白完全溶解。有些蛋白，如重組人IL-13 Variant (產(chǎn)品編號(hào)：200-13A)雖然難溶，但卻不需用搖床來加速溶解。其說明書上的備注為：Allow the reconstituted vial to sit at 4度 for at > 2 hours before use. (將重懸液在4度靜置2小時(shí)以上)。

五、注意事項(xiàng) 

1. 一定要用推薦的溶液溶解(或溶解)凍干粉 

2.一定要溶解到指定的濃度。

3.一定不能振蕩(vortex)。

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