無信號

一抗和二抗不匹配

二抗需和一抗宿主的物種相同（如一抗來自兔，二抗為抗兔抗體）。

沒有足夠的一抗或二抗結(jié)合目標(biāo)蛋白

使用高濃度抗體，延長4℃孵育時(shí)間（如過夜）。

封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)

使用溫和的去污劑如吐溫-20，或更換封閉劑（常用的脫脂奶粉、BSA、血清或明膠）。

一抗不識別檢測物種的蛋白

參照說明書，比對免疫原序列和蛋白序列以確?？贵w和目的蛋白會(huì)發(fā)生反應(yīng)，設(shè)置陽性對照。

抗原量不足

每泳道蛋白上樣量不低于20-30μg，使用蛋白酶抑制劑并設(shè)置陽性對照。

組織中目的蛋白含量低

濃縮使信號最大化（例如檢測核蛋白要用核裂解物）。

轉(zhuǎn)膜不充分

使用可逆染色劑例如麗春紅S檢測轉(zhuǎn)膜效果，檢查轉(zhuǎn)膜操作是否正確。PVDF膜需預(yù)先浸在甲醇中，然后浸到轉(zhuǎn)移緩沖液中。

洗膜過度

勿過度洗膜。

過度封閉使目標(biāo)蛋白不能顯色

代替5%脫脂奶粉，使用含0.5%脫脂奶粉或無脫脂奶粉的抗體稀釋液，或更換封閉劑，減少封閉時(shí)間。

一抗失效

使用新鮮一抗，重復(fù)使用有效濃度會(huì)降低。

二抗受疊氮鈉抑制

避免疊氮鈉和HRP標(biāo)記抗體一起使用。

檢測試劑盒過期和底物失活

使用新鮮的底物。

背景高

未進(jìn)行非特異性封閉或封閉不充分

延長封閉時(shí)間，考慮更換合適的封閉劑。推薦使用5%脫脂奶粉、3%BSA或血清封閉30分鐘。這些可以包含在抗體緩沖液中。

一抗?jié)舛冗^高

稀釋抗體至合適濃度，以更高稀釋度抗體孵育更長時(shí)間。

抗體孵育溫度過高

4℃孵育。

二抗與封閉劑非特異性結(jié)合或反應(yīng)

設(shè)置二抗對照（不加一抗）。

一抗或二抗與封閉劑有交叉反應(yīng)

在孵育和洗滌液中加入溫和去污劑如吐溫-20。脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，會(huì)結(jié)合磷酸化特異性抗體而易產(chǎn)生高背景。使用BSA代替奶粉作為封閉劑。

未結(jié)合蛋白質(zhì)洗滌不充分

增加洗滌次數(shù)。

膜的選擇導(dǎo)致的高背景

NC膜比PVDF膜背景低。

膜干燥

在孵育過程中防止膜變干，在任何步驟都保證膜有充分的反應(yīng)液，放入攪拌子不斷攪動(dòng)或輕輕震蕩使膜浸在溶液中。

多帶現(xiàn)象

細(xì)胞傳代次數(shù)過多，使其蛋白表達(dá)不同

使用原始未傳代的細(xì)胞株，和現(xiàn)在的細(xì)胞株一起做平行對照實(shí)驗(yàn)。

體內(nèi)表達(dá)的蛋白樣本具有多種修飾形式如乙?；?、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等

查閱文獻(xiàn)，使用試劑使樣品去磷酸化、去糖基化來驗(yàn)證翻譯后的修飾。

蛋白樣本降解（蛋白質(zhì)分子量降低）

在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑。

檢測到未經(jīng)報(bào)道過的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結(jié)構(gòu)不同的蛋白

查閱其他文獻(xiàn)報(bào)道，或BLAST搜尋，使用說明書推薦的細(xì)胞株或組織。

一抗?jié)舛冗^高，高濃度時(shí)常出現(xiàn)多條蛋白帶

降低抗體濃度和/或孵育時(shí)間。

二抗?jié)舛冗^高，高濃度產(chǎn)生非特異性結(jié)合

降低抗體濃度，增加二抗對照（不加一抗）。

抗體未經(jīng)純化

使用親和純化的抗體，減少非特異性條帶。

條帶為非特異性條帶

應(yīng)用封閉多肽來區(qū)分特異性和非特異性條帶，只有特異性條帶能被封閉從而消失

靶蛋白形成多聚體

SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10分鐘而不是5分鐘，使蛋白解聚

背景有不均勻的白色斑點(diǎn)

轉(zhuǎn)膜時(shí)膜上有氣泡或抗體在膜上分布不均

轉(zhuǎn)膜過程中盡量去除氣泡，抗體孵育時(shí)保持搖動(dòng)。

背景有黑色斑點(diǎn)

抗體結(jié)合了封閉劑

過濾封閉劑。

深背景出現(xiàn)白色條帶（非預(yù)期背景）

一抗或二抗加入過多

稀釋抗體的濃度。

分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)條帶呈黑色

抗體和分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)發(fā)生了反應(yīng)

在分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)和第一個(gè)樣品之間增加一個(gè)空白條帶。

目的條帶染色過低/過高

分離不徹底

改變凝膠比例：分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠。

“微笑”條帶

遷移過快；電泳溫度過高（改變了PH值和遷移速度）

降低遷移速度或低溫電泳（冰庫或冰上）。

相同的蛋白雜交出現(xiàn)大小不均勻條帶

制備凝膠時(shí)凝膠凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均勻

參照凝膠的配方，在凝膠中加入適量TEMED，放置時(shí)在凝膠頂部加入適量0.1%SDS（水稀釋）以防凝膠變干。

凝膠染色不均勻

細(xì)菌污染；抗體量不足

4℃保存抗體并使用新鮮的緩沖液浸泡凝膠；確保在振蕩孵育時(shí)抗體充分浸沒膜。