檢查流式細(xì)胞儀陽(yáng)性單一顏色對(duì)照是否正確，通道和補(bǔ)償設(shè)置是否能正確的捕獲所有粒子。

沒(méi)有足夠的抗體來(lái)檢測(cè)

增加抗體的量/濃度

無(wú)法接近細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)

檢查目標(biāo)蛋白是否在細(xì)胞內(nèi)。對(duì)于胞內(nèi)染色，確保有足夠的通透性。為防止細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的內(nèi)化，該過(guò)程應(yīng)用冰冷的試劑，在冰上或4℃進(jìn)行，以終止一切反應(yīng)。加入疊氮化鈉可防止表面抗原的修飾和內(nèi)化帶來(lái)的熒光強(qiáng)度的損失。對(duì)于細(xì)胞系染色，胰蛋白酶可以引起細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的內(nèi)化，尤其是細(xì)胞表面分子，可能需要更溫和的分離方法。

細(xì)胞內(nèi)染色結(jié)合熒光分子太大

對(duì)細(xì)胞內(nèi)染色實(shí)驗(yàn)，熒光分子應(yīng)具有較小的分子量。大分子量熒光染料會(huì)降低抗體的動(dòng)力和進(jìn)入細(xì)胞的可能性。

激光器未對(duì)齊

確保流式細(xì)胞儀的激光器正確對(duì)齊，必要時(shí)通過(guò)運(yùn)行液流檢查微球來(lái)調(diào)整路線。如果激光器不能正確對(duì)準(zhǔn)或發(fā)生漂移時(shí)，您可能需要考慮聯(lián)系此機(jī)的客服。

目標(biāo)蛋白不存在或處于低水平表達(dá)

確保組織或細(xì)胞類型表達(dá)的目標(biāo)蛋白處于一個(gè)足夠檢測(cè)的量。

可溶性或分泌型目標(biāo)蛋白

目標(biāo)蛋白是否可溶并從細(xì)胞內(nèi)分泌？需要嵌合在細(xì)胞膜上或存在于細(xì)胞質(zhì)里以便流式細(xì)胞儀能很容易檢測(cè)到。通過(guò)高爾基體封閉的步驟，比如加入Brefeldin A，可提高細(xì)胞內(nèi)染色信號(hào)。

補(bǔ)償過(guò)高或增益過(guò)低

使用陽(yáng)性對(duì)照再次設(shè)置流式細(xì)胞儀，利用補(bǔ)償以確保細(xì)胞的熒光信號(hào)不被切斷，提高增益以增強(qiáng)信號(hào)（在合理的范圍內(nèi)）。

熒光分子的熒光逐漸消退

抗體可能放置時(shí)間太長(zhǎng)或沒(méi)有避光。

一抗和二抗不匹配

二抗應(yīng)該是和一抗來(lái)源物種相同（例如一抗來(lái)源于兔，就要使用抗兔的二抗）。

熒光強(qiáng)度過(guò)高

抗體濃度過(guò)高

這將導(dǎo)致較高的非特異性結(jié)合或非常高的熒光強(qiáng)度，減少每個(gè)樣本中加入的抗體量。

過(guò)量抗體被困

這是細(xì)胞內(nèi)染色特有的問(wèn)題，較大的熒光分子使抗體被困在細(xì)胞中。確保洗滌步驟充分，包括在洗滌緩沖液中加入吐溫或Triton。

封閉不足

與封閉步驟一樣，抗體中加入1-3%封閉試劑。

背景高或陽(yáng)性細(xì)胞百分比高

增益設(shè)置過(guò)高或補(bǔ)償過(guò)低

使用陽(yáng)性對(duì)照再次設(shè)置流式細(xì)胞儀，用補(bǔ)償減少顆粒背景并減少增益以降低信號(hào)。

抗體過(guò)量

降低抗體濃度。您還可以在洗滌緩沖液中添加去污劑，以確保洗去多余的抗體。