細(xì)胞表面分子流式檢測(cè)步驟說(shuō)明注意事項(xiàng)

1． 在使用抗體之前，快速甩動(dòng)一下，使之聚集到管的底部；

2． 熒光標(biāo)記的抗體應(yīng)該避光保存在4℃，不要冷凍；

3． 當(dāng)染色的時(shí)候，固定或延遲分析可能降低某些抗體的熒光信號(hào)。為了得到更好的結(jié)果，染色后應(yīng)該馬上分析。

過(guò)程概述：

1． 制作外周血、淋巴組織或者培養(yǎng)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液；

2． 細(xì)胞染色抗體（包括直接標(biāo)記抗體和間接標(biāo)記抗體）；

3． 洗滌步驟棄掉所有的為束縛的試劑

4． 運(yùn)行分析流式儀。

注意：流式細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)中，所有實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化都很重要。關(guān)鍵參數(shù)包括靶細(xì)胞、抗體效價(jià)以及動(dòng)力學(xué)。

試驗(yàn)A：小鼠淋巴細(xì)胞懸液的免疫熒光染色

材料：12×75 mm的圓底試管（Falcon Cat.No.2008）或96孔圓底微量滴定板（Falcon Cat.No.3910），原始抗體（既未純化也未偶聯(lián)），

緩沖液： eBioscience流式染色緩沖液（Cat.No.00-4222），流式鞘液

儀器：移液管和移液器，離心機(jī)，冰柜或冰箱，流式儀

試驗(yàn)時(shí)間

半個(gè)小時(shí)細(xì)胞準(zhǔn)備，半個(gè)小時(shí)抗體稀釋和樣品準(zhǔn)備，半個(gè)小時(shí)到一個(gè)小時(shí)孵育過(guò)程，半個(gè)小時(shí)以上的運(yùn)行和分析時(shí)間

方法細(xì)胞準(zhǔn)備：

1． 采集組織（脾，淋巴結(jié)，胸腺），用注射器的活塞擠壓以制成單細(xì)胞懸液，此過(guò)程用10ml的染色緩沖液；

2． 轉(zhuǎn)移到50ml的圓錐形試管中并使大塊沉淀到試管底部或者通過(guò)尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，得到單細(xì)胞懸液；

3． 4℃ 離心沉淀細(xì)胞懸液4-5分鐘（300-400g），棄掉上清；

4． 如果上過(guò)程采集的脾，還用用RBC裂解，否則進(jìn)入下一步；

5． 用50ml染色液重懸樣本，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力分析；

6． 再次離心細(xì)胞，棄掉上清，重懸細(xì)胞使其細(xì)胞數(shù)達(dá)到2×107 個(gè)/ml；

抗體的準(zhǔn)備和孵育：

1． 用50 ?l染色液稀釋前面選的抗體，分裝到每個(gè)試管或微量滴定板的孔中。吸取50 ?l染色液到陰性對(duì)照試管中。在滴定實(shí)驗(yàn)中，滴定范圍是2-0.03?g/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；

2． 加入50 ?l細(xì)胞懸液（相當(dāng)于106個(gè)細(xì)胞）于每個(gè)試管或孔中，輕輕混勻；

3． 避光冰浴20分鐘。注意：某些抗體可能需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間，用預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索實(shí)驗(yàn)條件；

4． 孵育之后，加入染色液(試管2ml，微量滴定板200?l)；

5． 4℃ 離心沉淀細(xì)胞5分鐘（300-400g），吸掉上清；

6． 再重復(fù)洗2次；

7． 重懸已染色的細(xì)胞沉淀物，到流式細(xì)胞儀上分析。

a.如果用熒光標(biāo)記的抗體，用500 ?l染色液重懸已染色的細(xì)胞沉淀物，然后在流式細(xì)胞儀上分析。

b.如果用純化的或者生物素標(biāo)記的抗體，加入合適的50-100?l染色液（偶聯(lián)熒光染料的第二抗體或抗生物素蛋白）于每個(gè)樣品中。避光冰浴15-30分 鐘，按步驟4和5洗2次。用500 ?l染色液重懸已染色的細(xì)胞沉淀物，然后在流式細(xì)胞儀上分析。細(xì)胞染色法區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。

注意：如果同時(shí)加入多種熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，孵育和洗滌的步驟和上面的一樣。注意加入熒光抗體后的所有步驟都要在低溫避光的條件下進(jìn)行。

試驗(yàn)B: 人類(lèi)外周血的免疫熒光染色材料　　

12×75 mm的試管（Falcon Cat.No.2008）　　

抗體（未偶聯(lián)或偶聯(lián)熒光）　　

第二試劑，如果用間接染色緩沖液　　

eBioscience 流式染色液（Cat.No.00-4222）　　

鞘液　　

eBioscience 1×RBC Lysis Buffer（Cat.No.00-4333）

設(shè)備　　

移液管和移液器　　

離心機(jī)　　

冰柜或冰箱　　

流式儀試驗(yàn)時(shí)間半個(gè)小時(shí)抗體稀釋和樣品準(zhǔn)備半個(gè)小時(shí)到一個(gè)小時(shí)染色過(guò)程半個(gè)小時(shí)以上的運(yùn)行和分析時(shí)間方法

1． 用50?l染色液稀釋未偶聯(lián)或偶聯(lián)生物素的抗體，分裝到每個(gè)試管中。分裝50?l染色液到干凈的或陰性對(duì)照試管中。滴定ioscience抗人的偶聯(lián)熒光素的抗體20?l于每個(gè)樣品中；

2． 加100?l 全血到每個(gè)試管中，輕輕混勻；

3． 避光室溫孵育15-30分鐘。注意：某些抗體結(jié)合力較低可能需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間。預(yù)試驗(yàn)摸索這些條件。

4． 加2ml 1×RBC（預(yù)溫到室溫）于每個(gè)試管中，輕輕混勻；

5． 避光室溫孵育樣品10分鐘。用1×RBC 孵育不要超過(guò)15分鐘。

6． 室溫離心樣品（300-400g），抽吸掉上清液，然后用2ml 染色液洗一次。

7． 重懸已染色的細(xì)胞沉淀物，然后在流式細(xì)胞儀上分析樣品。

a. .如果用熒光標(biāo)記的抗體，用500 ?l染色液重懸已染色的細(xì)胞沉淀物，然后在流式細(xì)胞儀上分析。

b. .如果用純化的或者生物素標(biāo)記的抗體，加入合適的50-100?l染色液（偶聯(lián)熒光染料的第二抗體或抗生物素蛋白）于每個(gè)樣品中。避光冰浴15-30分 鐘，按步驟4和5洗2次。用500 ?l染色液重懸已染色的細(xì)胞沉淀物，然后在流式細(xì)胞儀上分析。細(xì)胞染色法區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。

注意：如果同時(shí)加入多種熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，孵育和洗滌的步驟和上面的一樣。注意加入熒光抗體后的所有步驟都要在低溫避光的條件下進(jìn)行。