免疫細胞化學(xué)/免疫熒光 (ICC/IF) 是一種使用熒光抗體或染料來檢測細胞內(nèi)靶抗原的技術(shù)。本實驗方案詳述了使用 Cytospin? 離心對懸浮細胞進行 ICC/IF 的流程。建議收藏本文。

一般流程

1.用聚乙烯亞胺或多聚賴氨酸涂覆蓋玻片，在室溫下放置 1 小時。

2.用無菌水充分漂洗蓋玻片 3 次，每次 1 小時。

3.充分干燥蓋玻片，在紫外光下滅菌至少 4 小時。

4.使細胞在玻璃蓋玻片上生長，或制備 Cytospin或涂片制備物。

5.用磷酸鹽緩沖液 (PBS) 簡單漂洗。

推薦使用 1 × PBS 0.1% Tween 20 作為洗滌緩沖液。

固定

可使用以下兩種方法中的一種固定細胞：

1.室溫下，在 100% 甲醇（-20 ℃ 冷凍）中孵育細胞 5 分鐘。

2.室溫下，在 4% 多聚甲醛（溶于 PBS 中，，pH 7.4）中孵育細胞 10 分鐘。用冰 PBS 洗滌細胞 3 次。

抗原修復(fù)（可選步驟）

在抗原修復(fù)緩沖液對細胞進行加熱處理后，有些抗體的效果會更好。查看產(chǎn)品信息，了解每種一抗的使用建議。

1.將抗原修復(fù)緩沖液（100 mM Tris，5% [w/v] 尿素，pH 9.5）預(yù)熱至 95 ℃。具體方法為：將裝有緩沖液的蓋玻片染色缸置于水浴鍋中，水浴鍋的溫度設(shè)為 95 ℃。

2.用小型寬頭鑷子小心將蓋玻片置于蓋玻片染色缸內(nèi)的抗原修復(fù)緩沖液中，記下長有細胞的蓋玻片面。

3.在 95 ℃ 下加熱蓋玻片 10 分鐘。

4.從抗原修復(fù)緩沖液中取出蓋玻片，浸入 6 孔組織培養(yǎng)板內(nèi)的 PBS 溶液中，保持長有細胞的一面朝上。

5.用 PBS 洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。

通透

如果靶蛋白位于細胞內(nèi)，對細胞進行通透處理尤為關(guān)鍵。用甲醇固定的樣品不需要進行通透處理。

1.用 PBS（含 0.1–0.25% Triton X-100 或 100 μM Digitonin 或 0.5% Saponin）孵育樣品 10 分鐘。Triton X-100 是用于提高抗體滲透性最常用的去垢劑。但 Triton X-100 會破壞細胞膜，因此不適用于細胞膜抗原。

2.確定每種目標(biāo)蛋白的 Triton X-100 最佳比例。

3.用 PBS 洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘

封閉與免疫染色

1.用 1% BSA、22.52 mg/mL 甘氨酸的 PBST (PBS + 0.1% Tween 20) 孵育細胞 30 分鐘，封閉抗體的非特異性結(jié)合（可替代的封閉液包括 1% 明膠或來源于產(chǎn)生二抗的物種的 10% 血清：查看抗體數(shù)據(jù)表了解相關(guān)建議）。

2. 室溫下，用稀釋抗體（溶于 1% BSA 的 PBST 中）在濕盒中孵育細胞 1 小時，或 4 ℃ 過夜孵育。

3.倒出溶液，用 PBS 洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。

4.室溫下，用二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育細胞 1 小時。

5.倒出二抗溶液，用 PBS 避光洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。

多色染色（可選步驟）

要檢測同一個樣品中兩種或多種抗原的共同分布情況，需要使用雙重免疫熒光流程。該流程可在混合物中同時進行檢測，也可逐個抗原依次進行檢測。

確?？贵w來源于不同物種并且這些抗體有相應(yīng)的二抗。例如，抗抗原 A 的兔抗體和抗抗原 B 的鼠抗體。也可使用偶聯(lián)至不同熒光團的直標(biāo)一抗。

同時孵育

1.用封閉液孵育細胞 30 分鐘。

2.室溫下，用兩種一抗（溶于 1% BSA 的 PBST 中）在濕盒中孵育細胞 1 小時，或 4 ℃ 過夜孵育。

3.倒出溶液，用 PBS 洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。

4.室溫下，用兩種二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育細胞 1 小時。

5.倒出二抗溶液，用 PBS 避光洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。

依次孵育

1.第一封閉步驟：室溫下，用第一封閉液（來源于產(chǎn)生二抗的物種的 10% 血清）孵育細胞 30 分鐘。

2.室溫下，用第一種一抗（溶于 1% BSA 或 1% 血清的 PBST 中）在濕盒中孵育細胞 1 小時，或 4 ℃ 過夜孵育（一抗溶于 1% 明膠或 1% BSA 的 PBST 中）。

3.倒出第一種一抗溶液，用 PBS 洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。

4.室溫下，用第一種二抗（溶于 1% BSA 的 PBST 中）避光孵育細胞 1 小時。

5.倒出第一種二抗溶液，用 PBS 避光洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。

6.第二封閉步驟：室溫下，用第二種血清（來源于產(chǎn)生二抗的物種的 10% 血清）避光孵育細胞 30 分鐘。

7.室溫下，用第二種一抗（溶于 1% BSA 或 1% 血清的 PBST 中）在濕盒中避光孵育細胞 1 小時，或 4 ℃ 過夜孵育。

8.倒出第二種一抗溶液，用 PBS 避光洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。

9.室溫下，用第二種二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育細胞 1 小時。

倒出第二種二抗溶液，用 PBS 避光洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。

如需檢測兩種以上的抗原，其余抗體按照步驟 1–5 繼續(xù)操作。

復(fù)染

1.用 0.1-1 μg/mL Hoechst 或 DAPI（DNA 染色）孵育細胞 1 分鐘。

2.用 PBS 漂洗細胞。

封片

1.用一滴封片介質(zhì)封閉蓋玻片。2.用指甲油密封蓋玻片，避免樣品變干和在顯微鏡下移動。3.-20 ℃ 或 4 ℃ 下避光保存。