1. 材料：

(1) TBS（Tris buffered saline）:5mM Tris，150mM Nacl，PH 7.4。

(2) 丙酮：分析純

(3) 封閉液：含10%FBS或1%BSA的TBS，F(xiàn)BS種屬與二抗來(lái)源種屬一致。

(4) 一抗：純化或生物素化規(guī)格。

(5) 二抗：生物素化。

(6) 顯色劑：抗生物素的eFluor 605NC（CAT#93-2317）或抗生物素的eFluor 650NC（CAT#95-2317）。

(7) 包埋劑：Fluoromount-G（southernBiotech）or Fluoro-Gel（EMS）。

(8) 濕盒。

2. 方案：

(1) 切片空氣干燥10min。

(2) 浸入丙酮固定10min。

(3) TBS室溫水化10min。注意：組織不能脫水，否則不利于染色。

(4) 室溫封閉1小時(shí)（100ul/組織），蓋膜防止蒸發(fā)。注意：PAP筆可能會(huì)干擾eFluor熒光在此不建議使用。

(5) 用鑷子小心移去膜，TBS，慢速振蕩洗滌3次，每次5min。

(6) 用封閉液按照說(shuō)明書(shū)稀釋一抗，加一抗?jié)窈兄惺覝胤跤?小時(shí)。低豐度的抗原一般4度孵育12小時(shí)以上。

(7) TBS洗3次，方法同上。

(8) 按建議濃度稀釋二抗，室溫孵育1小時(shí)。

(9) TBS洗3次，方法同上。

(10) 按建議濃度（1:100）稀釋顯影劑：抗生物素的eFluor 605NC（CAT#93-2317）或抗生物素的eFluor 650NC（CAT#95-2317）。室溫避光孵育30min。

(11) TBS洗3次，方法同上。

(12) 封片，4度避光保存或直接觀察拍照。