1. 實(shí)驗(yàn)材料：

(1) TBS和PBS。

(2) 固定液：4%甲醛或100%冰預(yù)冷甲醇。

(3) 破膜劑：（PBS配至，W/V）

(4) 封閉液：含10%FBS的 TBS，F(xiàn)BS種屬與二抗來(lái)源種屬一致；0.1%Triton X-100

(5) 一抗：純化級(jí)或生物素級(jí)別。

(6) 二抗：抗生物素的（三步法）或直標(biāo)的（二步法）。

(7) 顯色劑：抗生物素的eFluor 605NC（CAT#93-2317）或抗生物素的eFluor 650NC（CAT#95-2317）或抗生物素的FITC（CAT#11-4317）

(8) 包埋劑：Fluoromount-G（southernBiotech）or Fluoro-Gel（EMS）。

(9) 濕盒。

2. 實(shí)驗(yàn)步驟：

(1) 制備細(xì)胞涂片或爬片，細(xì)胞密度要適當(dāng)。

(2) 用4%甲醛室溫固定細(xì)胞15min或用100%甲醇-20度固定10min。

(3) PBS洗滌3次，每次5min。吸管滴加和吸取。注意：避免細(xì)胞干燥，以免增加非特異背景。

(4) 破膜劑破膜，蓋封口膜防止蒸發(fā)，濕盒室溫孵育10min后，37度孵育30min。

(5) PBS洗滌3次，每次5min。吸管滴加和吸取。

(6) 封閉液封閉細(xì)胞，每一小格100ul，（8格玻片）室溫濕盒孵育1小時(shí)。

(7) 小心移去封口膜，PBS洗滌3次，每次5min。吸管滴加和吸取。

(8) 用封閉液按照說(shuō)明書(shū)稀釋一抗，加一抗?jié)窈兄惺覝胤跤?小時(shí)。低豐度的抗原一般4度孵育12小時(shí)以上。

(9) TBS，慢速振蕩洗滌3次，每次5min。如果是未結(jié)合的一抗繼續(xù)步驟10（一步法）；如果是生物素化的一抗則跳到步驟12。

(10) 按照說(shuō)明書(shū)稀釋抗生物素或熒光標(biāo)記的二抗，蓋膜，室溫濕盒孵育1小時(shí)。注意：如果二抗是結(jié)合熒光素的，則需要避光并且去掉封閉液中的Triton X-100。

(11) TBS洗三次，方法同上。

(12) 按建議濃度（1:100）稀釋顯影劑：抗生物素的eFluor 605NC（CAT#93-2317）或抗生物素的eFluor 650NC（CAT#95-2317）或抗生物素的FITC（CAT#11-4317）。室溫避光孵育30min。

(13) TBS洗3次，方法同上。

(14) 封片，4度避光保存或直接熒光顯微鏡觀察拍照。