技術(shù)問題

一、綜合性問題

1、試劑表面基團的量或者濃度——需分表列明

PLL@Fe2O3表面帶的多聚賴氨酸量或是比例是多少

質(zhì)量比是PLL：Fe=0.2：1

2、濃度

（1）濃度

PEI@Fe3O4，PEG化氧化鐵，PLL@Fe2O3的鐵濃度是1mg/ml，

DMSA@Fe2O3，DMSA@Fe3O4和APTS@Fe2O3的鐵濃度是4mg/ml

OA@Fe3O4，檸檬酸鈉修飾的Fe3O4，納米銀漿按總質(zhì)量算

銀納米顆粒0.1mg/ml

金納米顆粒的OD值一般是5，金單質(zhì)的質(zhì)量0.05mg/ml(金質(zhì)量計)。

3、產(chǎn)品溶劑或產(chǎn)品成分

4、顆粒稀釋是否可以用去離子水？

可以

5、 產(chǎn)品如何滅菌？可以高溫或者其他手段？

產(chǎn)品在出售前已經(jīng)用0.22微米的濾膜除過菌，無需再次除菌。另高溫會破壞產(chǎn)品性狀，不可高溫滅菌

6、產(chǎn)品保質(zhì)期多久？在使用過程或者存放久了發(fā)生產(chǎn)品聚集的問題如何解決？

我們的產(chǎn)品保質(zhì)期是12個月。在保質(zhì)期內(nèi)，我們的產(chǎn)品一般是不會出現(xiàn)團聚現(xiàn)象的，若您買回的產(chǎn)品還未使用，也未添加任何試劑，又在保質(zhì)期內(nèi)，我們承諾是可以免費退換的。

7、磁性是多少？

70emu/g，我們產(chǎn)品的這個磁性強度還是比較大的，也是我們產(chǎn)品的優(yōu)勢之一。

8、生物相容性好，用什么數(shù)據(jù)說明呢？

做細胞活性實驗，加入量后，看細胞有沒有死亡,要是沒有死亡,說明相容性很好.

9、產(chǎn)品濃縮，如果離心一般多少轉(zhuǎn)速合適？

穩(wěn)定的話1萬30分鐘都不能完全離下來，不穩(wěn)定的話5000轉(zhuǎn)5分鐘就可以了。

10、納米顆粒的飽和磁化強度是用什么檢測的？

振動樣品磁強計。

11、3.5mg/mlMnZnFe2O4@OA中3.5mg/ml指什么？

3.5mg/ml就是Fe的含量。（OA是油酸）

12、你們磁性納米顆粒的制作方法是什么？共沉淀？

目前我們的產(chǎn)品大部分是用共沉淀法制得的，用共沉淀法制得產(chǎn)品也是最穩(wěn)定的，申請的國家二級標準物質(zhì)也是用共沉淀法制得的，我們這有高溫熱解法做的，但不能批量成產(chǎn)，所以價格比較貴。

13、你們的磁性納米顆粒怎么實現(xiàn)靶向的作用呢?

抗體靶向，或者用磁鐵吸。

14、你們在什么儀器上測粒徑分布的

DLS是粒度電位分析儀（Malvern，ZETA SIZER ，Nano ZS90），電鏡尺寸通過“力度分布計算”軟件分析得到的

二、DMSA@Fe3O4

1、DMSA@Fe3O4的摩爾濃度是多少呢？是用原子吸收測試的嗎？

A：因為產(chǎn)品的4mg/ml是以Fe來計的，所以該產(chǎn)品的摩爾濃度是4/56=0.0714mol/L.產(chǎn)品濃度不是用原子吸收測試的，是用紫外可見光譜測試的，用鄰二氮菲顯色測試的。

2、DMSA@Fe3O4怎么稀釋保存

超純水稀釋，然后用0.1M的四甲基氫氧化銨溶液調(diào)pH到中性或稍偏堿性保存。

3、DMSA@Fe3O4簡介

顆粒外圍是二巰基丁二酸，羧基來自于二巰基丁二酸，最外層就是羧基，電鏡尺寸一般在10nm左右。一般注射活體都用這個，二巰基丁二酸就是指DMSA。水相的磁性納米顆粒就是DMSA@Fe3O4。

4、小鼠MRI造影時的推薦用量（如DMSA@Fe3O4），不同腫瘤用量是否也會不同

稍有不同，可根據(jù)具體情況做相應(yīng)調(diào)整，一般的推薦用量是100mg鐵每千克小鼠體重

5、DMS@Fe3O4表面包被的是什么？

顆粒是DMSA表面修飾的

 6、有相應(yīng)的蛋白質(zhì)交聯(lián)試劑盒么？還是我們自己要摸索EDC+Solfo-NHS的用量？

可以用EDC/sulfo-NHS的方法偶聯(lián)，這個方法比較成熟，但是涉及到在納米顆粒偶聯(lián)的時候其實最主要的是要保持顆粒的穩(wěn)定性，顆粒的穩(wěn)定性與電荷有很大關(guān)系，所以用不同等電點的蛋白質(zhì)進行偶聯(lián)在反應(yīng)緩沖液pH上是不同的，所以我們沒辦法做出相應(yīng)的試劑盒。到時候我們會提供一個大概的偶聯(lián)步驟，里面有試劑、蛋白質(zhì)、偶聯(lián)劑的用量和緩沖液的信息等，基本您可以照著做，針對您的蛋白質(zhì)您還可以稍做一些調(diào)整，尤其是緩沖液的選擇。如果您實在不愿意做的話，也可以交給我們公司幫您做，公司也有定制化的業(yè)務(wù)，但需要另外收費。

三、DMSA@Fe2O3

1、羧基化Fe2O3磁性納米顆粒的水動力尺寸？

40-70nm。

四、PEI@Fe3O4

1、PEI_Fe3O4能否進入到細胞核

不能進入

2、產(chǎn)品是因為什么原因進不了細胞核呢？是粒徑大了進不去嗎？如果進行表面修飾，有可能進核嗎？怎樣修飾進核呢？你們公司能幫忙做修飾嗎？

3、貴公司用于RNA轉(zhuǎn)染的納米顆粒，其表面修飾的有機物是PEI嗎？有機物的含量是怎樣的呢？

我們公司的磁轉(zhuǎn)染納米材料是Fe3O4納米顆粒的核，表面用PEI修飾，PEI的量沒有做過具體分析，但表面電位較正，已經(jīng)可以證明PEI的成功修飾，如有必要后面可能會考慮做熱重等。

4、貴公司用于RNA轉(zhuǎn)染的納米顆粒電鏡尺寸如何？在超純水中的表面電勢是怎樣的？

電鏡尺寸在10nm左右，最終產(chǎn)品分散在純水中，zeta電位高于30mV（測量值一般在40～50mV之間）

5、為了直觀驗證RNA被轉(zhuǎn)入細胞，我想用熒光染料標記RNA，再與納米粒子結(jié)合，結(jié)合后是否會導致熒光的淬滅？

我們曾經(jīng)做過用熒光標記納米顆粒的研究，沒有發(fā)現(xiàn)會導致熒光淬滅的現(xiàn)象，只要您注意避光操作，應(yīng)該不會產(chǎn)生影響

6、與RNA混合后，粒子會否團聚？對轉(zhuǎn)染的效率影響如何？

A：與RNA混合后是否團聚主要與電荷有關(guān)，當溶液中負電荷過高時會導致團聚，團聚確實會影響轉(zhuǎn)染效率，且會導致細胞毒性增加。根據(jù)我們客戶的使用反饋，按照正常使用比例不會導致顆粒聚集，這也是我們產(chǎn)品的優(yōu)勢之一。

五、PEG化氧化鐵

1、在磁性納米顆粒上接分子量約3000的肽段，選PEG化的氧化鐵合適嗎？

合適，PEG化四氧化三鐵比其他同類產(chǎn)品更抗吞噬，靶向性更強

2、肽段修飾在磁性納米顆粒上，復(fù)合物的水動力尺寸還在納米級別嗎？

在的

3、小肽需要多少量？（PEG化磁性納米顆粒（羧基末端）5mg）

質(zhì)量比一般是Fe：小肽=1:0.5到1:1

4、貨期多長

定制一般是三個月

六、裸γ-Fe2O3

1、磁性納米材料的制備方法？

裸γ-Fe2O3的制備主要有兩種方法：共沉淀法和高溫熱解法。共沉淀法是目前用來批量生產(chǎn)磁性納米顆粒的主要方法，本實驗室也采用此方法，其缺點是顆粒分散不均勻，大小不均一。高溫熱解法是目前比較熱門的一種研究方法，目前不能批量生產(chǎn)，但是顆粒均勻分布TEM照片特別漂亮。若有客戶想要高溫熱解法的產(chǎn)品，可以提供，但是價格另算，要高很多。

七、細胞標記

1、干細胞標記方法？

取納米顆粒用無血清的培養(yǎng)液稀釋成20ug/mL左右，加入細胞，30min后補加血清，孵育12-24h.

2、細胞標記有哪些檢測方法？

一般是MRI造影和組織切片做普魯士藍染色

3、連接上抗體后是用紫外測試？還是用核磁質(zhì)譜分析呢？如何驗證連接的成功與否？

都可以，做紫外測試時，因為鐵的吸光度比較大，所以需要蛋白含量多一點，連接的多，看的也清楚，質(zhì)譜的也做，但是做的不多。要驗證連接的成功與否，做一個純化步驟，一般有離心或者過凝膠柱等，看分離出來的鐵那部分有無蛋白，若量多的話，用紫外直接做，因為是測試蛋白含量，推薦您使用BCA試劑。

4、你們有沒連接抗體的步驟，能不能發(fā)給我們先看一下？

抗體連接步驟很多，一般有EDC，但是具體的連接方法還是要自己查文獻的。

5、你們的納米顆粒被細胞吞噬的多？有沒有細胞毒性？應(yīng)該是吞噬的多好還是少好啊？

具體的吞噬多少是無法測試的，但是若用我們推薦的方法，我們可以保證細胞的標記率達90%以上。細胞毒性是有的，但是很低，要看細胞是不是比較敏感，一般40ug/mL是沒有問題的。若細胞吞噬的越多，毒性自然就大，但是吞噬的越多，實驗顯現(xiàn)的效果越好，所以要選一個合適的比例。

6、蛋白質(zhì)和磁珠的物質(zhì)的量的比是多少，畢竟我們的抗體是個單域抗體，分子量小很多。

我們是按質(zhì)量比來加的，F(xiàn)e跟抗體質(zhì)量比為1：1，我們的抗體分子量是150k，我們的體系里面抗體是過量的。

7、但是我們的抗體只有15k,也照質(zhì)量加的話會不會過量太多了？

如果抗體分子量小的話可以按質(zhì)量Fe:抗體=10：1。

8、在標記之后還是要濃縮一下的，還是大概超濾下好了？

最好不要，你們沒有合適的濃縮手段，很容易導致聚集的，盡量在偶聯(lián)過程中不要把體積打的太大。

9、Fe的最佳標記濃度是多少？拿到產(chǎn)品要不要做什么稀釋動作？

取微量鐵分散在培養(yǎng)液中，保證每ml培養(yǎng)液含20ug鐵，具體的量要根據(jù)客戶的實驗情況而定。

10、蛋白質(zhì)和磁珠反應(yīng)后如何分離？過柱子還是采用透析？多出來的硼酸體系要除去嗎？（袁輝老師）

如果穩(wěn)定的話可以過柱子，不穩(wěn)定的話適當離心即可，硼酸體系是用來緩沖的，不必去除。

八、造影

1、我們造影用的MRI機型及設(shè)置參數(shù)？

德國siemens公司 avanto 1.5T

2、做磁性靶向，需要推薦納米材料？

油酸修飾的、PEG修飾和DMSA修飾的都可以用。但是主推PEG@Fe3O4，因為有機相的不能用在動物體內(nèi)會有毒性，DMSA@Fe3O4（制備方便）屬于水相試劑，毒性小，PEG@Fe3O4為水相溶劑，毒性小，靶向性好

3、注射到小鼠體內(nèi)的劑量如何才能夠不導致小鼠的死亡？

A: 當注射劑量按照每千克體重0.5mg鐵的量注射時，小鼠是不會死亡的。（0.5mg/kg體重是推薦劑量，就是說這個劑量就會有效果，但是不能保證這個劑量就能夠不使得小鼠死亡，死亡的原因很多，如果注射速度過快也會導致死亡的）

4、小鼠注射時是不是轉(zhuǎn)換到PBS那種中性的環(huán)境比較保險呢，怕小鼠受不了

A：中性環(huán)境的進行偶聯(lián)反應(yīng)容易導致團聚，這個PH跟蛋白質(zhì)的等電點關(guān)系很大，您可以試下，我們就是這樣做的，我們偶聯(lián)的如avastin或者美羅華都必須在PH9下做。

特殊性問題

1、我們是用來看動脈粥樣硬化易損斑塊的，按照理論，我們是不希望被腹腔內(nèi)的巨噬細胞吞噬，希望都進入斑塊內(nèi)部？

若產(chǎn)品部穩(wěn)定，那被巨噬細胞吞噬的機會就會大一點，若產(chǎn)品穩(wěn)定的話，就比較容易進入斑塊內(nèi)部，之前東大有做過類似這樣干細胞的實驗，實驗結(jié)果就是進入斑塊內(nèi)部的比較多。我們的產(chǎn)品是比較穩(wěn)定的，分散性好，最終分散在水中，這也是我們的產(chǎn)品優(yōu)勢之一。

2、小鼠腫瘤注射的注射方案

按鐵濃度為1mg/ml算，注射量是腫瘤體積的一半（腫瘤體積計算方式是(ab2)/2,a是指腫瘤的長徑，b是指腫瘤的短徑）。值得注意的是注射需要比較細的針如胰腺灌注針進行多靶點注射

3、CT造影用碘油納米乳動物實驗

購買后一般4度密封可長期保存，也可在常溫下短期存放。這款產(chǎn)品相對比較穩(wěn)定，而且效果很好。小鼠注射量推薦量是100到200微升（碘濃度：48mg/ml），通過尾靜脈注射1到4小時內(nèi)會觀察到明顯的造影圖像。因為該造影劑被動靶向到肝，可設(shè)置不同時間節(jié)點的對照，比如1h，4h，8h，12h，24h等