沙門氏菌是一種革蘭氏陰性菌，其包含超過2,600種能夠在多種宿主中引起感染的血清型。該菌是胃腸道感染的最常見原因之一，沙門氏菌的感染源主要包括牛奶，雞蛋，肉類（家禽，牛肉），蔬菜和新鮮水果。每年導(dǎo)致全球數(shù)以千萬計(jì)的感染病例。在加拿大，沙門氏菌是最常見的食源性疾病的病原菌。在每年發(fā)生的400萬例食源性疾病中，非傷寒沙門氏菌占加拿大報(bào)告感染的約41％。歐盟每年報(bào)告超過100,000例沙門氏菌病，其中人類沙門氏菌病的費(fèi)用每年估計(jì)高達(dá)30億歐元。在美國，由于受沙門氏菌污染的食物來源的影響，社會工作效率降低、醫(yī)療保健成本增加，估計(jì)每年造成33億美元的損失。在許多低收入和中等收入國家，沙門氏菌所造成的經(jīng)濟(jì)和社會損失更是難以測算。此外，沙門氏菌也是動(dòng)物飼料和寵物食品中的主要致病性微生物。這些飼料的安全性不僅關(guān)乎動(dòng)物健康，還關(guān)乎動(dòng)物源食品或處理寵物食品的人員健康。

為了減少與食品和飼料產(chǎn)品相關(guān)的沙門氏菌爆發(fā)和疾病，需要從農(nóng)場到餐桌進(jìn)行多環(huán)節(jié)的檢測和控制。目前，沙門氏菌檢測和鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法主要包括細(xì)菌分離和生化鑒定?；谂囵B(yǎng)法的細(xì)菌分離雖然結(jié)果可信度高，但耗時(shí)費(fèi)力（通常需要5-7天）且在腸桿菌科下不同物種之間可發(fā)生交叉生化反應(yīng)。以聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）為代表的高靈敏度和特異性的核酸擴(kuò)增方法已廣泛應(yīng)用于沙門氏菌等病原微生物的檢測。然而，檢測結(jié)果的判斷主要依賴于傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測，由于需使用含有毒性的核酸染料等試劑，實(shí)驗(yàn)安全性有待提高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)等能夠在不使用有毒試劑的情況下對靶標(biāo)進(jìn)行定量檢測，但由于儀器和試劑成本較高而未能在基層和實(shí)際檢驗(yàn)工作中廣泛使用。因此，亟需開發(fā)一種能夠提高沙門氏菌檢出率，縮短檢測時(shí)間，不需要昂貴的設(shè)備和試劑的分子檢測方法以有效防控沙門氏菌的傳播。

隨著納米材料與技術(shù)的發(fā)展，磁性微球（磁珠）成為分子細(xì)胞生物學(xué)研究、分子診斷、免疫診斷及細(xì)胞分選中極為重要的工具和核心原材料。MagBeadsTM磁性微球系列是東納生物的明星產(chǎn)品，其采用經(jīng)典的核殼結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)制造，內(nèi)核為聚合物微球，外層為磁性物質(zhì)，最外層采用特殊聚合物修飾，具有尺寸分布均一、表面負(fù)載量高、極短的磁響應(yīng)時(shí)間、高的分散穩(wěn)定性等特點(diǎn)，可以快速、高效地從樣本中分離出待測物，極大地提高檢測效率。目前MagBeadsTM系列磁性微球已廣泛應(yīng)用于核酸提取、DNA捕獲與傳感技術(shù)、PCR產(chǎn)物純化、測序產(chǎn)物純化、核酸轉(zhuǎn)染、抗體純化、細(xì)胞分選、特定蛋白分離、化學(xué)發(fā)光檢測、模擬酶等諸多領(lǐng)域，獲得眾多知名的大學(xué)、研究機(jī)構(gòu)與臨床診斷實(shí)驗(yàn)室研究人員的廣泛好評。

圖1：MagBeadsTM系列磁性微球

基于東納生物研發(fā)團(tuán)隊(duì)在MagBeadsTM系列磁性微球的研究基礎(chǔ)，東南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院研究人員與東納生物合作開發(fā)出一種PCR產(chǎn)物磁珠法純化聯(lián)合快速熒光定量檢測試劑盒（PCR-LFIA），使用磁珠去除PCR產(chǎn)物中的引物二聚體，使用熒光微球作為熒光信號放大器，確保檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度。使用配套檢測平臺Nanoeasy 1700，可快速實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果數(shù)字化定量。該試劑盒在保持PCR特異性的基礎(chǔ)上，靈敏度可比普通PCR高2~3個(gè)數(shù)量級，與熒光定量PCR相當(dāng)，且不涉及有毒試劑。儀器簡便、易于攜帶，通過互聯(lián)網(wǎng)可實(shí)時(shí)共享測試結(jié)果。PCR-LFIA檢測法快速，靈敏，特異且安全，在疾病診斷、食品檢驗(yàn)和環(huán)境微生物監(jiān)測方面具有廣泛的應(yīng)用潛力，尤其適合即時(shí)診斷（POCT）應(yīng)用。

圖2：快速熒光定量檢測平臺Nanoeasy 1700和系列試劑盒

在寵物病原微生物檢測研究的基礎(chǔ)上，項(xiàng)目組研究人員以沙門氏菌（Salmonella spp.）為檢測對象，基于沙門氏菌特異性保守基因bcf設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，優(yōu)化出LFIA的最佳工作反應(yīng)體系（100 μL）和反應(yīng)時(shí)間（2 min）。經(jīng)18株細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株驗(yàn)證，PCR-LFIA法能特異性地檢測出沙門氏菌。檢測靈敏度為6×100 CFU/mL（純培養(yǎng)物）或6×102 CFU/mL（人工糞便感染物），且與常規(guī)培養(yǎng)法在分離樣品中的檢測結(jié)果一致（7.1％陽性，6/85），Cut-off值為175。檢測結(jié)果通過Sanger測序和BLAST進(jìn)一步驗(yàn)證。從PCR步驟開始整個(gè)過程僅需約80分鐘。

研究成果已被2019 IEEE 19th International Conference on Nanotechnology（IEEE-NANO）收錄，相關(guān)成果已經(jīng)申請國家發(fā)明專利。

圖3：PCR-LFIA法檢測沙門氏菌示意圖

圖4：PCR-LFIA法檢測沙門氏菌方法的建立. A，PCR產(chǎn)物純化試劑盒在沙門氏菌擴(kuò)增產(chǎn)物上的應(yīng)用結(jié)果；B，通過暗場成像觀察PCR產(chǎn)物純化試劑盒的純化效果；C，快速熒光定量檢測平臺測試PCR產(chǎn)物純化結(jié)果

圖5：PCR-LFIA法檢測沙門氏菌方法的靈敏度測試. A，PCR結(jié)果使用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證；B，快速熒光定量檢測平臺讀取PCR結(jié)果；C，梯度稀釋的樣品對應(yīng)的熒光值標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6：PCR-LFIA法檢測沙門氏菌方法的特異性測試.

圖7：PCR-LFIA法檢測沙門氏菌人工糞便感染物靈敏度測試.

圖8：PCR-LFIA法檢測分離樣品中沙門氏菌的結(jié)果

參考文獻(xiàn)

1. Yoshida C, Gurnik S, Ahmad A, Blimkie T, Murphy SA, Kropinski AM, Nash JH. Evaluation of molecular methods for identification of Salmonella serovars. J Clin Microbiol. 2016, 54(8): 1992-8.

2. Yang Q, Domesle KJ, Wang F, Ge B. Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time. BMC Microbiol. 2016, 16(1): 112.

3. Zhuang L, Ji Y, Tian P, Wang K, Kou C, Gu N, Zhang Y. Polymerase chain reaction combined with fluorescent lateral flow immunoassay based on magnetic purification for rapid detection of canine parvovirus 2. BMC Vet Res. 2019, 15(1): 30.