Arcrain站友是流式中文網(wǎng)資深的熱心站友，往往不言則已，言必驚人。前兩天，在回答站友問(wèn)題時(shí)，十分詳細(xì)地講解了流式分選儀的性能指標(biāo)，并穿插了不少分選的實(shí)用技巧，不收藏真是可惜了。

分選效率和分選純度是選擇流式分選儀很重要的性能指標(biāo)。

分選純度很簡(jiǎn)單，是你最后得到的細(xì)胞當(dāng)中，有百分之多少是目標(biāo)細(xì)胞。分選完了之后，立即再用分選得到的細(xì)胞上樣一檢測(cè)就可以知道了。

分選效率：一般所說(shuō)的分選效率應(yīng)該是指分選門(mén)內(nèi)有百分之多少的細(xì)胞被儀器分選出來(lái)。這個(gè)與你設(shè)定的分選模式、跑樣速度、儀器液滴震蕩頻率、目標(biāo)細(xì)胞的百分比、電子系統(tǒng)性能等都有關(guān)系。

分選模式影響很大

富集模式下，只要有符合要求（分選門(mén)里的細(xì)胞）的細(xì)胞，那么不管是不是同時(shí)還存在非目標(biāo)細(xì)胞，儀器都會(huì)將其分選出來(lái)。（通?？梢杂糜诜诌x很低比例的細(xì)胞，保證得到足夠數(shù)量的目標(biāo)細(xì)胞，這時(shí)純度會(huì)有所降低，但分選順利的話(huà)依然是能夠達(dá)到到90%，95%甚至97%純的，當(dāng)然與樣本有關(guān)）。

純度模式下，一個(gè)液滴中只有目標(biāo)細(xì)胞且沒(méi)有非目標(biāo)細(xì)胞，而且離這個(gè)目的細(xì)胞前后一定范圍（可以設(shè)定）沒(méi)有非目標(biāo)細(xì)胞，它才會(huì)被分選。通常都是用純度模式。

單細(xì)胞模式就更嚴(yán)格了，目標(biāo)細(xì)胞必須位于液滴中間位置，前后液滴沒(méi)有其它細(xì)胞，才會(huì)被分選。一般用于多孔板單克隆分選，長(zhǎng)單克隆的。

主要是這三種模式，還有一些介于這三種之間的組合。

液滴震蕩頻率

就是每秒鐘產(chǎn)生多少個(gè)液滴。如70um的噴嘴一般能到80KHZ左右，就是每秒鐘8萬(wàn)個(gè)液滴。顯然，跑樣速度不能高于這個(gè)數(shù)，否則就不是一個(gè)液滴一個(gè)細(xì)胞了。當(dāng)然，低于這個(gè)數(shù)值的跑樣速度也不能就一定保證一個(gè)液滴一個(gè)細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞間的間距是隨機(jī)的，還會(huì)粘連，因此有空液滴，也有兩三個(gè)細(xì)胞一個(gè)在一個(gè)液滴中的。另外，儀器一般會(huì)“看”前、中、后三個(gè)液滴，根據(jù)你的分選模式做出分選決定。（如，純度模式下，細(xì)胞靠近液滴上端，且后一個(gè)液滴沒(méi)有非目標(biāo)細(xì)胞，儀器會(huì)把這兩個(gè)液滴都分選出來(lái)，以保證一定能得到這個(gè)細(xì)胞。因?yàn)橐旱螖嗔褧r(shí)這個(gè)位置的細(xì)胞也可能位于后一個(gè)液滴中）。跑樣太快了，被儀器丟棄的細(xì)胞就會(huì)多，分選效率就下來(lái)了（但分選速度仍會(huì)增加，看你的取舍了）。告訴你一個(gè)實(shí)用的經(jīng)驗(yàn)，

一般情況下，跑樣速度控制在震蕩頻率的1/4-1/3能較好保證效率

（當(dāng)然，你一定要自己多觀(guān)察。目標(biāo)細(xì)胞比例太低，分選效率也會(huì)降低，這時(shí)要保證效率就要減速了。不同儀器電子系統(tǒng)性能不同，同等情況下效率也不相同，這些都需要操作者觀(guān)察積累經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)具體樣本和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)操作。）

分選的回收率

就是最終你得到的目標(biāo)細(xì)胞占樣本中目標(biāo)細(xì)胞的百分比?；厥章矢诌x效率不太一樣，并不是儀器顯示分選出了多少個(gè)細(xì)胞，你就得到了多少個(gè)細(xì)胞，實(shí)際得到的細(xì)胞數(shù)量要比它少。例如，細(xì)胞如果死亡嚴(yán)重會(huì)讓你損失很多細(xì)胞。有的儀器容易分選出空液滴，實(shí)際得到的細(xì)胞數(shù)量偏離儀器顯示的分選細(xì)胞數(shù)目更遠(yuǎn)，各種因素加起來(lái)，可能你得到的細(xì)胞數(shù)目還不到儀器計(jì)數(shù)的1/3，甚至更低。

所以細(xì)胞活性也很重要，除非你不管死活。用不同尺寸的噴準(zhǔn)分選不同大小的細(xì)胞，除了防止堵塞，另一個(gè)目的就是提高細(xì)胞活性。細(xì)胞在流式上跑樣時(shí)是會(huì)受到損傷的（不要聽(tīng)廠(chǎng)商銷(xiāo)售說(shuō)的分選對(duì)細(xì)胞沒(méi)有影響。）。有的分選儀就優(yōu)化了對(duì)細(xì)胞活性的保護(hù)，可以非常好的保證脆弱細(xì)胞的存活。（例如，據(jù)我所知，脆弱的神經(jīng)干細(xì)胞都能有90%的存活，其它條件當(dāng)然也要配合才行，這玩意可是放到PBS里就會(huì)死的。）不同尺寸的噴嘴對(duì)應(yīng)的液滴振蕩頻率不同，能達(dá)到的分選速度有很大差異。尺寸越大，鞘液壓力越低，液滴頻率越低，最大分選速度就越低，但細(xì)胞活性越好。

分選速度

分選速度也是個(gè)重要的性能指標(biāo)。了解了液滴頻率，其實(shí)就可以明白，物理規(guī)律都一樣，不同儀器能達(dá)到的液滴頻率也基本差不多，只要不是太差，同等情況實(shí)際分選速度不會(huì)相差很大。（高分選效率和回收率的儀器當(dāng)然可以適當(dāng)提高分選速度）。

綜合各方面性能來(lái)考慮，不同分選儀差別是蠻明顯的。

96孔板分選，不用管細(xì)胞大小，就用100um或以上的噴嘴吧，單細(xì)胞模式分選。這個(gè)分選又基本不要求速度。

液流穩(wěn)定性和落點(diǎn)問(wèn)題，儀器機(jī)械性能當(dāng)然很重要，這個(gè)改變不了，但一般都是非?？煽?。儀器所處環(huán)境溫度波動(dòng)會(huì)有影響較長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)。噴嘴是否有瑕疵，調(diào)節(jié)的分選液流質(zhì)量，鞘液罐是有點(diǎn)否漏氣，過(guò)濾器是否有氣泡，噴嘴是否干凈，分選模式是否合適這幾個(gè)方面可以考慮。

只要各個(gè)地方都沒(méi)有問(wèn)題，分選儀是會(huì)非常穩(wěn)定的！