方案A：組織培養(yǎng)細胞的制備。

方案B：淋巴組織細胞制備。

方案C：非淋巴組織細胞制備。

方案D：全血PBMC的分離。

小貼士

1、流式細胞儀檢測需要將細胞制備成單細胞懸液。

2、避免細胞成團，以免堵塞流式細胞儀。

3、實體組織制備單細胞懸液需要物理方法分離或酶消化法進行，具體組織的方法，依照經驗來進行。

方案A: 組織培養(yǎng)細胞的制備

實驗材料：

Accutase? 酶細胞分離培養(yǎng)基 (eBioscience Cat. No. 00-4555)

eBioscience? 流式染色緩沖液 (eBioscience Cat. No. 00-4222)

15ml或50ml的離心管。

實驗流程：

1、如果是懸浮細胞，則小心將細胞移入離心管中，進行計數(shù)和活力分析。進行步驟3.

2、如果是貼壁細胞，建議使用Accutase? 酶細胞分離培養(yǎng)基 (eBioscience Cat. No. 00-4555)是細胞團塊分離，制備成單細胞懸液后置于離心管中計數(shù)和活力分析。（注意:accutase 可能會改變某些細胞表位，應該預實驗觀察避免其干擾檢測）

3、300g 離心5min。棄去上清，應用適量的流式染色緩沖液重懸細胞，調整細胞濃度為2×107/ml。

方案B：淋巴組織細胞制備。

實驗材料：

60×15mm 的組織培養(yǎng)皿

5ml 注射器

細胞過濾器（尼龍網過濾）

eBioscience? 流式染色緩沖液 (eBioscience Cat. No. 00-4222) 

15ml或50ml的離心管。

實驗方案：

1、獲取組織（脾臟，淋巴結或胸腺）加入5~10ml eBioscience? 流式染色緩沖液 (eBioscience Cat. No. 00-4222)，使用5ml注射器注射心研磨組織（或采用兩片載玻片研磨亦可）。 

2、收集磨碎的細胞懸液，過濾至離心管中計數(shù)和活力分析。 

3、300g 離心5min。棄去上清，應用適量的流式染色緩沖液重懸細胞，調整細胞濃度為2×107/ml。

方案C：非淋巴組織細胞制備。

剪刀和手術刀片

剪刀和手術刀片 

PBS 

60×15mm 的組織培養(yǎng)皿     

5ml 注射器 

細胞過濾器（尼龍網過濾） 

eBioscience? 流式染色緩沖液 (eBioscience Cat. No. 00-4222) 

15ml或50ml的離心管。

實驗流程:

1、獲取組織剪碎或切碎組織為2~4mm碎塊，用PBS稀釋適量的酶進行消化（溫度，方法依照酶的說明書）。 

2、小心分離細胞團塊，過濾除去死細胞和碎片。 

3、300g 離心5min，棄去上清。加PBS 5ml 300g 離心5min，棄去上清，重復一次。計數(shù)和活力分析。 

4、300g 離心5min，棄去上清，應用適量的流式染色緩沖液重懸細胞，調整細胞濃度為2×107/ml。

方案D：全血PBMC的分離。

實驗材料： 

PBS 

Ficoll? 淋巴細胞分離液 

eBioscience? 流式染色緩沖液 (eBioscience Cat. No. 00-4222) 

15ml或50ml的離心管。

實驗流程： 

1、以PBS 1:1稀釋血樣。將血樣輕輕加到2ml Ficoll? 淋巴細胞分離液或其他品牌亦可。 

2、1000g離心20min,小心吸取分離液和PBS之間的霧狀細胞，即為PBMC。至新的離心管中。 

3、4度，300g 離心5min,棄上清。應用適量的流式染色緩沖液重懸細胞，計數(shù)和細胞活力，調整細胞濃度為2×107/ml。